Métodos y medios para la proliferación de células madres y generación y expansión posterior de células progenitoras, así como producción de células efectoras como terapéuticos clínicos.

Un medio para el cultivo, la expansión y/o diferenciación de células madres, dicho medio comprende un medio de cultivo de células básico

, 1-20 % de suero humano, 2-10 mmol/O-acetil-L-carnitina , 40-80 mg/l de heparina Ndesulfatada- N-acetilada y una combinación de citocinas adecuadas, que preferentemente abarca tres o más de trombopoyetina, ligando flt-3, factor de células madres, G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-I-α, y LIF.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2006/000484.

Solicitante: IPD-Therapeutics B.V.

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: Onderwijsboulevard 219 5228 DE's-Hertogenbosch PAISES BAJOS.

Inventor/es: SPANHOLTZ,JAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/02 (Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0783 (Células T; Células NK; Progenitores de células T o NK)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0789 (Células madre; Células progenitoras multipotentes)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/074 (Células madre adultas)

PDF original: ES-2502841_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos y medios para la proliferación de células madres y generación y expansión posterior de células progenitoras, así como producción de células efectoras como terapéuticos clínicos.

La invención se refiere al campo de la biología médica moderna. Particularmente la invención se refiere a la tecnología de células madres. Más particularmente la invención se refiere a la tecnología de células madres perinatales, particularmente tecnología de células madres de cordón umbilical.

Las células madres son células indiferenciadas primordiales que tienen la habilidad de auto-renovación y la habilidad de diferenciarse en otros tipos de células. Esta habilidad les permite actuar como un sistema de reparación para el cuerpo, reponer otras células mientras el organismo está vivo.

Las células madres se clasifican por potencia que describe la especificidad de esa célula.

Las células madres totipotentes son células que tienen la habilidad de auto-renovación y son capaces de diferenciarse en cualquier y todos los tipos celulares para formar un nuevo organismo completo. Ellas se producen típicamente por la fusión de un óvulo y un espermatozoide. Las células producidas por las primeras pocas divisiones del óvulo fertilizado además son totipotentes. Estas células pueden convertirse en cualquier tipo de célula sin excepciones.

Las células madres pluripotentes son las descendientes de las células totipotentes y pueden convertirse en cualquier tipo celular excepto por las células madres totipotentes.

Las células madres multipotentes pueden producir solamente células de una familia de células estrechamente relacionadas (por ejemplo las células madres hematopoyéticas pueden diferenciarse en células de la sangre tales como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) .

Las células progenitoras (algunas veces llamadas unipotentes) pueden producir solamente un tipo celular; pero, tienen la propiedad de auto-renovación que las distingue de las células no madres.

Las células madres además se categorizan de acuerdo con su fuente, como adultas o embrionarias.

Las células madres adultas son células indiferenciadas encontradas entre las células diferenciadas de un tejido específico y son en su mayoría células multipotentes. Con más precisión se les llama células madres somáticas, porque no necesitan venir de adultos sino que además pueden venir de niños o de cordones umbilicales.

Las células madres embrionarias son células obtenidas a partir de la masa interior indiferenciada de un blastocito, un embrión en una etapa temprana de 50 a 150 células.

La sangre de la placenta y el cordón umbilical que quedan después del nacimiento es una fuente de células madres adultas. Se recogen al separar el cordón umbilical, limpiarlo y extraer la sangre de la vena umbilical.

Los glóbulos rojos se pueden eliminar de la sangre del cordón y las células remanentes se pueden usar o almacenar (por ejemplo en nitrógeno líquido) .

Las células madres mismas son útiles en muchas aplicaciones de la llamada medicina regenerativa. Se usan para tratar enfermedades del corazón, reparar médulas espinales y muchas otras enfermedades donde los tejidos de todo tipo necesitan remplazarse.

Las células madres además pueden usarse para producir ciertos tipos de células diferenciadas que son células efectoras en ciertas enfermedades.

Desafortunadamente sin embargo, las células madres están presentes en el cuerpo de un mamífero en diminutas cantidades solamente. A menudo están presentes en órganos o tejidos que no se alcanzan con facilidad. Las células 55 madres embrionarias además no se obtienen fácilmente y solamente en diminutas cantidades. Además, hay algunas preocupaciones éticas en el crecimiento de embriones meramente con el propósito de producir células madres. Hay por lo tanto una necesidad de métodos para multiplicar células madres disponibles y/o progenie específicas de linaje primitivo de estas, sin que se diferencien en descendientes menos potentes. Las células madres totipotentes deben permanecer totipotentes después de la expansión y no convertirse en células madres pluripotentes, las células madres pluripotentes

deben permanecer pluripotentes, etc. En algunos casos el cambio a un descendiente menos potente puede ser aceptable (al menos hasta cierto punto) siempre que el potencial para la auto-renovación y al menos la multipotencia se retengan.

Aunque las células madres tienen la habilidad de auto-renovación, mantener células madres en cultivo, no es una tarea fácil. En su sentido más amplio la presente invención proporciona un medio y un método para el cultivo y/o la expansión y/o la diferenciación de células madres que comprende un número de elementos que son extremadamente adecuados justo para ese propósito, con la condición de que las células no son células embrionarias humanas. Las "células madres" de la presente invención no son células embrionarias humanas.

Así en una modalidad la invención proporciona un medio para cultivar, expandir y/o diferenciar células madres, dicho medio que comprende un medio de cultivo celular básico, 1-20 % suero humano, 2-10 mmol/l O-acetil-L-carnitina o un equivalente funcional de este, 40-80 mg/l heparina N-desulfatada-N-acetilada o un equivalente funcional de esta y una combinación de citocinas adecuadas, que preferentemente abarca tres o más de trombopoyetina, ligando flt-3, factor de células madres, G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-I-α, y LIF, y suplementos convencionales adicionales, tales como L-glutamina, antibióticos, ácido ascórbico, selenito de selenio y etanolamina. Las citocinas dadas se seleccionan por sus funciones. Para algunas de las citocinas dadas hay otras citocinas que al menos en parte serán capaces de realizar la misma función. Aquellas pueden entonces por supuesto sustituir las enumeradas.

Preferentemente un medio de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 3-8, con mayor preferencia aproximadamente 5 mmol/l de O-acetil-L-carnitina. Un equivalente funcional puede estar presente en diferentes cantidades que son equivalentes en actividad a las cantidades dadas para la O-acetil-L-carnitina.

Preferentemente un medio de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 50-70, con mayor preferencia aproximadamente 60 mg/l de heparina N-desulfatada-N-acetilada. Un equivalente funcional puede estar presente en diferentes cantidades que son equivalentes en actividad a las cantidades dadas para la heparina N-desulfatada-N-acetilada.

Las cantidades de citocina añadidas son convencionales en la técnica, cantidades preferidas se dan en los ejemplos, pero desviaciones del 10 % en cantidad son muy aceptables y dentro del alcance de la presente invención.

Muchos medios básicos son conocidos. Más abajo, se da una selección pero muchos más se pueden comprar a empresas como Invitrogen. Los medios básicos incluyen pero no se limitan a BEM (medio de Eagle básico) , DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) , medio esencial mínimo de Glasgow, medio basal M199, HAM F10, HAM F12, DMEM de Iscove, Leibovitz L15, MCDB, McCoy 5A, etc.

Se pueden usar además las combinaciones de estos medios básicos y combinaciones de DMEM y HAM F12 se prefieren para algunos medios de diferenciación de acuerdo con la invención. Las cantidades dadas en la presente descripción son típicamente adecuadas para cultivos que comienzan con aproximadamente 1 millón de células por ml. Las cantidades se pueden adaptar para las diferentes cantidades de células con las que comienzan los cultivos.

Los medios de acuerdo con la invención pueden variar en su contenido de suero, preferentemente junto con una combinación... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un medio para el cultivo, la expansión y/o diferenciación de células madres, dicho medio comprende un medio de cultivo de células básico, 1-20 % de suero humano, 2-10 mmol/O-acetil-L-carnitina .

4. 80 mg/l de heparina N

desulfatada-N-acetilada y una combinación de citocinas adecuadas, que preferentemente abarca tres o más de trombopoyetina, ligando flt-3, factor de células madres, G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-I-α, y LIF.

2. Un medio de acuerdo con la reivindicación 1, donde el medio comprende aproximadamente 3-8, con mayor preferencia aproximadamente 5 mmol/l de O-acetil-L-carnitina.

3. Un medio de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende aproximadament.

5. 70, con mayor preferencia aproximadamente 60 mg/l de heparina N-desulfatada-N-acetilada.

4. Un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para expandir células madres dicho medio

comprende un medio para expandir células madres que comprende un medio de cultivo celular básico, 10-20 % de suero humano, 2-10 mmol/l de O-acetil-L-carnitina .

4. 80 mg/l de heparina N-desulfatada-N-acetilada y una combinación de citocinas adecuadas que preferentemente abarca tres o más de trombopoyetina ligando flt-3, factor de células madres, G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-I-α, y LIF.

5. Un medio para la expansión de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende aproximadamente 15 % de suero humano, de preferencia suero AB.

6. Un medio para la expansión de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que comprende aproximadamente 5 mmol/l de O-acetil-L-carnitina.

7. Un medio para la expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que comprende 60 mg/l heparina N-desulfatada-N-acetilada.

8. Un medio para la expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-7 en donde el medio básico es 30 RPMI1640.

9. Un medio para la expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-8, que comprende trombopoyetina, ligando flt-3, factor de células madres, G-CSF, GM-CSF, IL-6, MIP-I-α, LIF, VEGF, bFGF, IL-3 e IL

7.

10. Un medio de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para diferenciar células madres en progenitores de células asesinas naturales, que comprende entre 5-10 % de suero humano

11. Un medio de acuerdo con la reivindicación 10 en el cual la cantidad de suero es aproximadamente 8 %.

12. Un medio para la diferenciación de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 que comprende aproximadamente 5 mmol/l de O-acetil-L-carnitina.

13. Un medio para la diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende 60 mg/l 45 de heparina N-desulfatada-N-acetilada.

14. Un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde el medio básico es una mezcla de 2:1 (v/v) DMEM y HAM-F12.

15. Un medio inicial de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14 en donde la combinación de citocinas es TPO, FLT-3L, SCF, IL-7, VEGF, IL-2, GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-I-α e IL-6.

16. Un medio inicial de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en donde la combinación de citocinas es TPO, FLT-3, SCF, IL-7, IL15, IL-2, GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-I-α e IL-6.

17. Un estuche de partes para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras de NK , que comprende un medio de expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, y un medio de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14.

18. Un estuche de partes para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras de NK , que comprende un medio de expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, y un medio de diferenciación inicial de acuerdo con la reivindicación 15 y un medio de diferenciación secundario de acuerdo con la reivindicación 16.

19. Un estuche de partes para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras de NK, que comprende expandir las células madres en un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, diferenciar las células expandidas en un medio de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14.

20. Un método para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras de NK, que comprende expandir células madres en un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, diferenciar las células expandidas en un medio inicial de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 15 y diferenciar más aun las células resultantes en un medio de diferenciación secundario de acuerdo con la reivindicación 16.

21. Un método para expandir células madres que comprende cultivar dichas células madres es un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9.

22. Un método para diferenciar células madres que comprende cultivar células madres, preferentemente células madres expandidas, en células progenitoras de NK en un medio de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14.

23. Un método para diferenciar células madres que comprende cultivar células madres, preferentemente células madres expandidas, en células progenitoras de NK en un medio inicial de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 15 y diferenciar más aun las células resultantes en un medio secundario de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 16.

24. Un medio de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para diferenciar células madres en células progenitoras vasculares, que comprende 7-12 %, preferentemente aproximadamente 10 % de suero humano (preferentemente AB) .

25. Un medio de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el medio básico es medio basal M199.

26. Un medio inicial de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, en donde la combinación de citocinas es SCGF, VEGF, angiopoyetina-1, angiopoyetina-2, bFGF, IGF, TPO, FLT-3L, II-1β, GM-CSF, G-CSF, LIF, MIP-I-α e II-6.

27. Un medio secundario de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la combinación de citocinas comprende SCGF, VEGF, bFGF, IGF, TPO, FLT-3L e IL-1β y la cantidad de suero humano es 1-4 %, preferentemente aproximadamente 2 %.

28. Un método para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras vasculares, que comprende expandir las células madres en un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, diferenciar las células expandidas en un medio de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 24 o 25.

29. Un método para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras vasculares, que comprende expandir células madres en un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, diferenciar las células expandidas en un medio inicial de diferenciación de acuerdo con la reivindicación 26 y diferenciar más aun las células resultantes en un medio de diferenciación secundario de acuerdo con la reivindicación 27.

30. Un método para diferenciar células madres que comprende cultivar células madres, preferentemente células madres expandidas, en células progenitoras vasculares en un medio de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

2. 25.

31. Un método para diferenciar células madres que comprende cultivar las células madres, preferentemente células madres expandidas, en células progenitoras vasculares en un medio inicial de diferenciación de acuerdo con la

reivindicación 26 y diferenciar más aun las células resultantes en un medio de diferenciación secundario de acuerdo con la reivindicación 27.

32. Un estuche de partes para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras vasculares, que comprende un medio de expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, y un medio de diferenciación de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

2. 25.

33. Un estuche de partes para expandir y diferenciar células madres en células progenitoras vasculares, que comprende un medio de expansión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, un medio de diferenciación inicial de acuerdo con la reivindicación 26 y un medio de diferenciación secundario de acuerdo con la reivindicación 27.