Métodos y kits para el diagnóstico de la diabetes tipo 2.

Métodos y kits para el diagnóstico de la diabetes tipo 2.

La invención se refiere a métodos para el diagnóstico de la diabetes tipo 2,

así como los agentes antidiabéticos para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo 2. La invención se refiere también a kits y ácidos nucleicos para la realización de los métodos de diagnóstico.

METODOS y KITS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA DIABETES TIPO 2

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona métodos y kits para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 mediante la determinación del patrón de metilación en el promotor del gen KCNJ11 en muestras de ADN de sangre periférica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La diabetes tipo 2 es la forma más común de diabetes y actualmente se está convirtiendo en una pandemia de rápido crecimiento. La diabetes tipo 2 está influenciada por factores del estilo de vida, tales como la edad, la obesidad y el embarazo, pero también tiene un sólido componente genético (Ridderstrale M and L. Groop 2009. Molecular and Cellular Endocrinology, 297:10-17) . Además, estudios recientes proponen que los cambios específicos en el epigenoma se asocian con la aparición y progresión de diabetes (Pinney SE and RA Simmons. 2010. Trends in Endocrinology & Metabolism, 21:223-229; Pirola L., el al. 2010. Nature Reviews Endocrinology, 6:665-675; Wren JD and Garner HR. 2005. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2005: 104-112; Slomko H., el al. 2012. Endocrinology, 153:1025-1030; Bouchard L. , el al. 2010. Diabetes Care, 33:2436-2441 ) .

La metilación del ADN y las modificaciones en las histonas son los principales eventos moleculares que inician y sostienen modificaciones epigenéticas. Sólo unos pocos estudios hasta la fecha han documentado alteraciones aberrantes de metilación del ADN en la diabetes tipo 2.

WO 2012/097903 A1 Y Volkmar M., el al. (Volkmar M., el al. 2012. EMBO J., 31 (6) :1405-1426) describen un método para predecir, pronosticar o diagnosticar la diabetes tipo 2 que comprende la medición del estado de metilación de uno o más sitios CpG de diferentes genes en una muestra. Dicho método revela 276 dinucleótidos CpG metilados diferencialmente en muestras de islotes pancreáticos de pacientes diabéticos tipo 2 correspondientes a 254 genes. Sin embargo, dichas alteraciones no se detectan en muestras de sangre.

Salvo un error de laboratorio, estos pacientes son propensos a tener resultados analíticos cerca de las márgenes del umbral para el diagnóstico y permanecen sin un diagnóstico definido. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos alternativos y precisos para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 que no dependan del estado de ayuno del sujeto ni de inexactitudes de laboratorio.

EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 en un sujeto que comprende:

(i) determinar el patrón de metilación en uno o más sitio (s) CpG del promotor del gen KCNJ11 seleccionado de aquellos sitios CpG tal como se definen en las Tablas 1 y 2 en una muestra biológica de dicho sujeto que contiene material genético, y

(ii) comparar el patrón de metilación de dicho uno o más sitio (s) CpG obtenidos en la etapa (i) con el patrón de metilación de dichos sitio (s) CpG en una muestra de referencia,

donde a) una disminución en el nivel de metilación de uno o mas sitio (s) CpG seleccionados de la Tabla 1 en un sujeto con respecto a la muestra de referencia o b) un aumento en el nivel de metilación de uno o mas sitio (s) CpG

seleccionados de la Tabla 2 en un sujeto con respecto a la muestra de referencia o c) una combinación de a) y b) es indicativo de que el sujeto sufre de diabetes tipo 2.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de la diabetes tipo 2 en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de un agente antidiabético en el que dicho sujeto muestra a) una disminución en el nivel de metilación de uno o más sitio (s) CpG seleccionados de la Tabla 1 con respecto a la muestra de referencia,

b) un aumento en el nivel de metilación de uno o más sitio (s) CpG seleccionados de la Tabla 2 con respecto a la muestra de referencia,

e) una disminución en la media del nivel de metilación de los sitios CpG de la Tabla 3,

d) un aumento en la media del nivel de metilación de dichos sitios CpG de la Tabla 4,

e) un aumento en la media del nivel de metilación de dichos sitios CpG de la Tabla 5 o f) una combinación de cualquiera de a) , b) , e) , d) y e) .

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos un oligonucleótido o polinucleótido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CpG del promotor del gen KCNJ11 seleccionado de los sitio (s) CpG tal como se define en la Tabla 1 y 2 de una manera específica de metilación.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende al menos 9 nucleótidos contiguos de la región promotora del gen KCNJ11 y en el cual la secuencia de bases contigua comprende al menos un sitio CpG seleccionado entre aquellos sitios CpG tal como se define en las Tablas 1 y 2, un ácido nucleico que comprende al menos 9 nucleótidos contiguos de la región promotora del gen KCNJ11 en el cual la posición correspondiente a la C en al menos un sitio CpG es un uracilo o un polinucleótido que se hibrida específicamente a cualquiera de dichos ácidos nucleicos.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del kit de la invención o del ácido nucleico de la invención para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 en un sujeto.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Curva ROC de la condición de la diabetes tipo 2 según la metilación del ADN de 14-20 CpG en el promotor KCNJ11 en el ADN de sangre periférica.

Figura 2. Diagrama de cajas de valores de metilación de 11 -28 CpG en el promotor KCNJ 11 en controles con normopeso, controles con sobrepeso, sujetos con prediabetes, diabéticos tipo 1 (DM1) Y pacientes con diabetes tipo 2 (DM2) , en el ADN de sangre periférica.

DESCRIPCiÓN DHALLADA DE LA INVENCiÓN Los autores de la presente invención han desarrollado un método para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 en un paciente basado en la determinación del patrón de metilación del ADN en la región promotora del gen KCNJ11 en una muestra de dicho paciente seguido de la comparación de dicho patrón de metilación con el patrón de metilación de una muestra de referencia. Este método tiene la ventaja de que es más sencillo y menos invasivo debido a que puede llevarse a cabo en sangre periférica en lugar de en una biopsia, y es independiente del estado de ayuno del paciente. Además, este método es más específico que los análisis basados en glucosa en plasma o sangre glicosilada, y es más cómodo para el paciente que una prueba de tolerancia a la glucosa oral.

Los autores de la presente invención han identificado un patrón de metilación específico relacionado con la diabetes tipo 2 en el promotor del gen KCNJ11 en sangre periférica. En concreto, 25 sitios CpG de los 27 analizados presentaron valores diferentes de metilación (p <0, 0001) entre los pacientes con diabetes tipo 2 y los controles con sobrepeso. Además, el estudio de sujetos controles con normopeso, sujetos prediabéticos y pacientes diabéticos tipo 1 reveló que el patrón de metilación del promotor del gen KCNJ11 encontrado en pacientes diabéticos tipo 2 era exclusivo de la diabetes tipo 2. Así pues, este patrón diferencialmente metilado podría ser utilizado como un biomarcador potencial de la diabetes tipo 2. Por consiguiente, el método desarrollado por los autores de la presente invención permite un diagnóstico diferencial entre diabetes tipo 2 y diabetes tipo 1 o prediabetes.

Método para el diagnóstico de la diabetes tipo 2.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 en un sujeto (en lo sucesivo denominado el "método de diagnóstico de la invención") , que comprende:

(i) determinar el patrón de metilación en uno o más sitio (s) CpG del

promotor del gen KCNJ11 seleccionados de aquellos sitios CpG tal

como se definen en las Tablas 1 y 2 en una muestra biológica de dicho

sujeto que contiene material genético, y

(ii) comparar el patrón de metilación de dichos uno o más sitio (s) CpG

obtenido en la etapa (i) con el patrón de metilación de dichos sitio (s)

CpG en una muestra de referencia,

donde

a) una disminución en el nivel de metilación de uno o mas sitio (s) CpG seleccionados de la Tabla 1 en un sujeto con respecto a la muestra de referencia o b) un aumento en el nivel de metilación de uno o más sitio (s) CpG seleccionados de la Tabla 2 en un sujeto con respecto a la muestra de referencia o e) una combinación de a) y b) es indicativo de que el sujeto sufre de diabetes tipo 2.

El término "determinar... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar diabetes tipo 2 en un sujeto que comprende:

(i) determinar el patrón de metilación en uno o más sitio (s) CpG del promotor del gen KCNJ11 seleccionadode aquellos sitios CpG tal como se definen en las Tablas 1 y 2 en una muestra biológica de dicho sujeto que contiene material genético, y

(ii) comparar el patrón de metilación de dichos uno o más sitio (s) CpG obtenido en la etapa (i) con el patrón de metilación de dichos sitio (s) CpG en una muestra de referencia,

donde a) una disminución en el nivel de metilación de uno o más sitio (s) CpG seleccionados de la Tabla 1 con respecto a la muestra de referencia o b) un aumento en el nivel de metilación de uno o más silio (s) CpG seleccionados de la Tabla 2 con respecto a la muestra de referencia o c) una combinación de a) y b) es indicativo de que el sujeto sufre de diabetes tipo 2.

2. El método según la reivindicación 1, en el cual la determinación del patrón de metilación comprende la determinación del patrón de metilación de todos los sitios CpG de la Tabla 3, en el cual una disminución en la media del nivel de metilación de dichos sitios CpG de la Tabla 3 con respecto a la muestra de referencia indica que el sujeto sufre de diabetes tipo 2.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el cual la determinación del patrón de metilación comprende: a) la determinación del patrón de metilación de todos los sitios CpG de la Tabla 4, b) la determinación del patrón de metilación de todos los sitios CpG de la Tabla 5 o

c) una combinación de a) y b) . yen el cual si la media del nivel de metilación de dichos sitios CpG de la Tabla 4, de la tabla 5 o la combinación de los mismos esta incrementada con respecto a la muestra de referencia indica que el sujeto sufre de diabetes tipo 2.

4. El método según la reivindicación 1, en el cual la determinación del patrón de metilación comprende la determinación del patrón de metilación de todos los sitios CpG de las Tablas 1 y 2.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el patrón de metilación se mide por un método seleccionado del grupo que consiste en PCR específica de metilación ("Methylation-specific peROl, MSP) , un método basado en enriquecimiento (p. ej., MeDIP, MBD-seq y MethyICap) , secuenciación por bisulfito y el método basado en bisulfito (p. ej., RRBS, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight) y un método de restricción-digestión (p. ej., MREseq) , o conversión diferencial, restricción diferencial, peso diferencial de los sitio (s) CpG metilados del AON del promotor del gen KCNJ11 en una muestra biológica que contiene material genético en comparación con la muestra de referencia.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual la muestra de referencia es una muestra de sujetos emparejados por edad e índice de masa corporal con el sujeto analizado.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual el sujeto no ha recibido un tratamiento antidiabético previo a la obtención de la muestra.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual la muestra biológica que contiene material genético es sangre periférica, plasma o suero.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual la muestra se ha tratado con un reactivo capaz de convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectable diferencialmente de la citosina en términos de propiedades de hibridación.

10. Un kit que comprende al menos un oligonucleótido o polinucleótido capaz de hibridar con al menos una secuencia de un sitio CpG del promotor del gen KCNJ11 seleccionado de aquellos sitio (s) CpG tal como se definen en la Tablas 1 Y 2 de una manera específica de metilación.

. Un kit según la reivindicación 10 que comprende un primer oligonucleótido o polinucleótido capaz de hibridar específicamente a un polinucleótido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CpG del promotor del gen KCNJ11 cuando dicho sitio CpG está metilado, y al menos un oligonucleótido o polinucleótido capaz de hibridar específicamente con el mismo polinucleótido tratado con bisulfito que comprende al menos una secuencia de un sitio CpG del promotor del gen KCNJ11 cuando dicho sitio CpG no está metilado.

12. Un kit de acuerdo con las reivindicaciones 10 o 11 , que comprende oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar con todos los sitios CpG del promotor del gen KCNJ11 tal como se define en las Tablas 1 y 2 de una manera específica de metilación.

13. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además uno o más reactivos para convertir una citosina no metilada en uracilo o en otra base que es detectable diferencialmente de la citosina en términos de propiedades de hibridación.

14. Un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

(i) Un ácido nucleico que comprende al menos 9 nucleótidos contiguos de la región promotora del gen KCNJ11 y en el cual la secuencia de bases contigua comprende al menos un sitio CpG seleccionado entre aquellos sitios CpG tal como se define en las Tablas 1 y 2,

(ii) un ácido nucleico que comprende al menos 9 nucleótidos contiguos de la región promotora del promotor del gen KCNJ11 en el cual la posición correspondiente a la e en al menos un sitio CpG seleccionado de aquellos sitios CpG tal como se definen en las Tablas 1 y 2 es un uracilo y

(iii) un polinucleótido se hibrida específicamente a cualquiera de dichos ácidos nucleicos.

15. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 o de un ácido nucleico según la reivindicación 14 para el diagnóstico de la diabetes tipo 2 en un sujeto.