Métodos para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o subespecie.

Un método para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica,

a nivel de especie y/o de subespecie, usando el análisis de MALDI-TOF-MS que comprende una etapa de clasificación del germen en un grupo antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, en el que dicho análisis de MALDI-TOF-MS comprende la etapa de comparar el perfil de espectros de la cepa que se va a identificar con una base de datos de referencia que contiene los espectros de MALDI-TOF-MS característicos de las cepas representativas de la genoespecie del grupo de gérmenes al que pertenece dicha cepa que se va a identificar, conteniendo dicha base de datos, para cada cepa representativa, los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0,05, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos

Métodos para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o subespecie Descripción La invención se refiere a un método para la identificación precisa y rápida a nivel de especie y/o a nivel de subespecie de un aislado clínico usando espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz con un analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) .

MALDI-TOF-MS es una técnica usada para examinar el perfil de proteínas detectado directamente de la superficie celular bacteriana intacta.

Se trata de un método de ionización suave basado en masas moleculares relativas que permiten la desorción de péptidos y proteínas de diferentes microorganismos enteros cultivados. Los iones se separan y se detectan de acuerdo con su masa molecular y su carga. Las especies se identifican por su masa: relación de carga (m/z) . Este enfoque produce un espectro reproducible en minutos que consiste en una serie de picos de 500 a 20.000 m/z. Cada pico corresponde a un fragmento molecular liberado de la superficie celular durante la desorción por láser.

MALDI-TOF-MS ya se ha usado para la caracterización de las bacterias. Sin embargo, entre los diversos componentes identificados en un espectro, solo unos cuantos están presentes en una gran población de gérmenes de una genoespecie dada, bien siendo el resto aislados de manera específica o variables en base a las condiciones de crecimiento (medios, temperatura de incubación, etc.) , y no se pueden usar para identificar la especie o subespecie de una bacteria y, más en general, de un germen.

La falta de una estrategia global para identificar esos picos de los espectros que pueden servir para distinguir diversas genoespecies ha dificultado el uso de MALDI-TOF-MS en los laboratorios de microbiología clínica habituales para el diagnóstico de genoespecies. De hecho, estos picos tienen que corresponder a componentes que estén presentes en la mayoría de los aislados de una genoespecie dada y que estén presentes en gran cantidad en la pared celular. Teniendo en cuenta la posible variabilidad en una genoespecie, es probable que la característica de una genoespecie no se base en la presencia de un solo pico, sino más bien en la presencia de un conjunto de picos que estén más o menos conservados entre la genoespecie.

Los antecedentes relevantes de la técnica están representados por los documentos DE 10 2005 002672 A1; US 2002/192676 A1; Dare D., en: ADV TECHNIQUES IN DIAGNOSTIC MICROBIOL, 2006, 117-133; Du Z et al., ANAL CHEM, 74 (21) , 2002, 5487-5491; Walker J et al., J MICROBIOL METHODS, 48 (2-3) , 2002, 117-126; Smole S. C. et al., J MICROBIOL METHODS, 48 (2-3) , 2002, 107-115; Keys C. J. et al., INFECTION GENETICS & EVOL, 4 (3) , 2004, 221-242; WO 98/09314 A; US-B1-7 020 559; US-B1-6 177 266; WO 01/92872 A; Coales M. C. et al., ABSTR GENERAL MEETING AM SOC MICROBIOL, vol. 102, 2002, página 103, C -25; Nagai R. et al., J BONE JOINT SURG BR PROCEEDINGS, vol. 88 - B, 2006, página 238; y Nielsen P. B. et al., CLIN MICROBIOL INFECT, 11 (supl. 2) , 2005, página 210, P723.

Los inventores han encontrado que dichos problemas se podrían resolver (i) mediante la realización de un análisis fenotípico del germen que se vaya a identificar antes del análisis de MALDI-TOF-MS, y (ii) mediante la realización del análisis de MALDI-TOF-MS en condiciones específicas relativas particularmente a la selección de la solución de la matriz y las bases de datos de referencia.

Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar un nuevo método basado en el análisis de MALDI-TOF-MS para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o de subespecie.

Es un objeto de la invención proporcionar bases de datos establecidas a partir de un conjunto de cepas con respecto a un germen dado.

Así pues, la invención se refiere a un método para la identificación, a nivel de especie y/o de subespecie, de una cepa aislada de una muestra clínica usando el análisis de MALDI-TOF-MS que comprende una etapa de clasificación de la cepa en un grupo antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, en el que dicho análisis de MALDI-TOF-MS comprende la etapa de comparar el perfil de espectros de la cepa que se va a identificar con una base de datos de referencia que contiene los espectros de MALDI-TOF-MS característicos de las cepas representativas de la genoespecie del grupo de gérmenes al que pertenece dicha cepa que se va a identificar, conteniendo dicha base de datos para cada cepa representativa los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0, 05, más particularmente superior a 0, 1, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos, preferentemente 5 o incluso 10

o más.

Dicho método puede comprender la etapa de mantener en el espectro de la cepa analizada los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a

0, 05, más particularmente superior a 0, 1.

La selección de picos llevada a cabo de acuerdo con la invención permite identificar con exactitud el germen presente en una muestra clínica.

La etapa de clasificación se basa en las condiciones de crecimiento y/o la característica de las colonias y/o la morfología de las bacterias ante el examen microscópico y/o la tinción de Gram y/o pruebas fenotípicas sencillas.

La técnica de MALDI-TOF-MS se lleva a cabo en células enteras intactas o en extractos de proteínas obtenidos tras la lisis o correspondientes a una fracción de los componentes celulares (pared celular, citoplasma, etc.) . Lo ideal es realizar esta técnica en una colonia aislada de la cepa que se vaya a identificar, obtenida a partir de una muestra clínica cultivada en un medio de crecimiento apropiado e incubada a una temperatura apropiada.

Antes de realizar la técnica de MALDI-TOF-MS, se añade un medio de matriz a las colonias aisladas.

Los medios de matriz adecuados comprenden, por ejemplo, derivados de ácido benzoico tales como ácido hidroxibenzoico, particularmente ácido 2, 5-dihidroxibenzoico (DHB) .

Cada espectro es la suma de al menos 400 disparos de láser, preferentemente más de 1.000, e incluso más de 2.000, desde diferentes regiones del pocillo que contiene la cepa que se va a analizar, siendo dicho espectro analizado en un intervalo de m/z de 500 a 50.000, y más preferentemente de entre 500 y 20.000, y más preferentemente de entre 2.000 y 20.000.

A continuación, se comparan los perfiles usando un programa informático que selecciona la mejor coincidencia entre la cepa analizada y los picos seleccionados de dicha base de datos de referencia obtenida mediante el análisis de una o varias cepas de referencia específicas de una genoespecie o genosubespecie dada. Cada cepa representa una genoespecie o genosubespecie del grupo en estudio, de manera que el conjunto de cepas corresponde a la genoespecie o genosubespecie pertinente de un grupo de gérmenes. El espectro de cada cepa de referencia se registra usando la técnica de MALDI-TOF-MS. Como se ha mencionado anteriormente, el pico con la intensidad más elevada se fija arbitrariamente en 1, y el resto de picos tiene un valor correspondiente a la intensidad relativa de este pico más elevado. Los picos presentes con una intensidad relativa superior a 0, 05 o más particularmente superior a 0, 1 se retienen, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos, preferentemente 5 o incluso 10 o más. Estos picos son los picos seleccionados.

Teniendo en cuenta una posible variación, el programa informático selecciona la mejor coincidencia entre la cepa analizada y la base de datos, teniendo en cuenta un posible error del valor m/z. El intervalo del error se fija arbitrariamente en 20, o más preferentemente en 10.

La presencia y ausencia de picos se consideran los identificadores genéticos de un determinado aislado.

Dicho método es una potente herramienta para la identificación rápida de un germen, lo que permite su uso en el diagnóstico habitual de laboratorio. La necesidad de un equipo costoso se compensa con la simplicidad del protocolo, que requiere un tiempo de práctica mínimo. Es especialmente apropiado para los laboratorios de referencia o los hospitales que reciben un alto volumen de muestras.

La alta resolución del método MALDI-TOF-MS realizado de acuerdo con la invención hace que sea posible, por ejemplo, obtener huellas espectrales características para cada especie e incluso subespecie de un germen dado.

Resulta ventajoso usar dicho método para la identificación... [Seguir leyendo]

1. Un método para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica, a nivel de especie y/o de subespecie, usando el análisis de MALDI-TOF-MS que comprende una etapa de clasificación del germen en un 5 grupo antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, en el que dicho análisis de MALDI-TOF-MS comprende la etapa de comparar el perfil de espectros de la cepa que se va a identificar con una base de datos de referencia que contiene los espectros de MALDI-TOF-MS característicos de las cepas representativas de la genoespecie del grupo de gérmenes al que pertenece dicha cepa que se va a identificar, conteniendo dicha base de datos, para cada cepa representativa, los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0, 05, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha base de datos contiene, para cada cepa representativa, picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0, 1.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la etapa de clasificación se basa en las condiciones de crecimiento y/o la característica de las colonias y/o la morfología de las bacterias ante el examen microscópico y/o la tinción de Gram y/o pruebas fenotípicas sencillas.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la realización de la técnica de MALDITOF-MS en células enteras intactas o en extractos de proteínas obtenidos tras la lisis o correspondientes a una fracción de los componentes celulares.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la adición de un derivado de ácido benzoico como medio de matriz a las colonias aisladas antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, siendo dicho derivado seleccionado del grupo que comprende DHB.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada espectro es la suma de al menos 400 disparos de láser, preferentemente más de 1.000, incluso más preferentemente más de 2.000, procedentes de diferentes regiones del pocillo que contiene la cepa que se va a analizar, siendo dicho espectro analizado en un intervalo de m/z de 500 a 50.000.

7. El método de la reivindicación 6, que comprende el uso de al menos 1.000 disparos de láser.

8. El método de la reivindicación 7, que comprende el uso de al menos 2.000 disparos de láser.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho espectro se analiza en un intervalo de m/z de entre 500 y 20.000.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho espectro se analiza en un intervalo de m/z de entre 2.000 y

20.000.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cepa por identificar se selecciona del

grupo que comprende bacterias. 45

12. El método de la reivindicación 11, en el que la bacteria es un estafilococo coagulasa negativa.

13. El método de la reivindicación 11, en el que la bacteria es un bacilo Gram negativo no fermentador.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cepa por identificar se selecciona del grupo que comprende levaduras.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cepa por identificar se selecciona del

grupo que comprende mohos. 55

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende la conservación, en el espectro de la cepa analizada, de picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0, 05.

17. El método de la reivindicación 16, que comprende la conservación de los picos que tienen una intensidad relativa superior a 0, 1.