Métodos para el diagnóstico y el tratamiento de la epilepsia.

Un método para diagnosticar predictivamente la probabilidad de que un paciente sufra de SMEI que comprende:

(i) secuenciar el gen SC1NA de un paciente con el fin de detectar una mutación en el gen SCN1A del paciente, incluida en una región reguladora del gen, en una muestra del paciente;

(ii) determinar si la mutación ha sido detectada previamente, o no, en el gen SCN1A de los sujetos y se sabe que está asociada a la SMEI, o no ha sido asociada previamente a la SMEI, donde, cuando la mutación identificada no ha sido asociada previamente a la SMEI, los padres o familiares del paciente también se someten a análisis para determinar si la mutación del paciente ha surgido de novo. donde dicho diagnóstico predictivo de riesgo de SMEI es de la manera siguiente:

(a) si la mutación ha sido asociada previamente a la SMEI, entonces se prevé una alta probabilidad de riesgo de SMEI;

(b) si la mutación es conocida y no ha sido asociada previamente a la SMEI, entonces se prevé una baja probabilidad de riesgo de SMEI; y

(c) si la mutación no ha sido identificada previamente y se ha demostrado que ha surgido de novo, existe una alta probabilidad de riesgo de SMEI y un riesgo aún mayor si la mutación se identifica como una mutación de truncamiento.

Métodos para el diagnóstico y el tratamiento de la epilepsia Ã?rea técnica La presente invención se refiere al diagnóstico y el tratamiento de la epilepsia, particularmente de la epilepsia mioclónica grave infantil (SMEI) .

Antecedentes técnicos Las epilepsias constituyen una colección variada de trastornos cerebrales que afectan a alrededor del 3% de la población en algún momento de su vida (Annegers, 1996) . Una crisis epiléptica se puede definir como un cambio episódico en el comportamiento causado por la activación desordenada de las poblaciones de neuronas del sistema nervioso central. Esto resulta en diferentes grados de contracción muscular involuntaria y a menudo en pérdida de la conciencia. Los síndromes epilépticos se han clasificado en más de 40 tipos distintos basados en síntomas característicos, tipos de crisis, causa, edad de inicio y patrones EEG (Comisión de clasificación y terminología de la Liga Internacional contra la epilepsia, 1989) . Sin embargo la única característica que es común a todos los síndromes es el persistente aumento de la excitabilidad neuronal que se expresa tanto ocasional como imprevisiblemente como una crisis.

Se ha estimado que en aproximadamente el 40% de las personas afectadas está presente una contribución genética a la etiología de la epilepsia (Gardiner, 2000) . Como las crisis epilépticas pueden ser el punto final de una serie de aberraciones moleculares que en última instancia perturban la sincronía neuronal, es probable que la base genética de la epilepsia sea heterogénea. Hay más de 200 enfermedades mendelianas que incluyen la epilepsia como parte del fenotipo. En estas enfermedades, las crisis epilépticas son sintomáticas de la implicación neurológica subyacente como alteraciones en la estructura o función cerebrales. En contraste, también hay una cantidad de síndromes epilépticos "puros" en los cuales la epilepsia es la única manifestación en los individuos afectados. Éstos se denominan idiopáticos y representan más del 60% de todos los casos de epilepsia.

Las epilepsias idiopáticas se han dividido además en los subtipos parcial y generalizada. Las crisis epilépticas parciales (focales o locales) surgen de descargas corticales localizadas, de modo que sólo ciertos grupos de músculos están implicados y puede mantenerse la conciencia (Sutton, 1990) . Sin embargo, en la epilepsia generalizada, la descarga EEG no muestra ningún foco de modo que todas las regiones subcorticales del cerebro están involucradas. Aunque la observación de que las epilepsias generalizadas son con frecuencia heredadas es comprensible, el mecanismo por el cual los defectos genéticos, que presumiblemente se expresan constitutivamente en el cerebro, dan lugar a crisis parciales es menos claro.

Las epilepsias idiopáticas generalizadas (IGE) son el grupo más común de epilepsia humana heredada y no tienen una herencia simple. Se conocen dos grandes grupos de IGE, las epilepsias idiopáticas generalizadas clásicas (Comisión de clasificación y terminología de la Liga Internacional contra la epilepsia, 1989) y el síndrome genético recientemente reconocido de epilepsia generalizada con convulsiones febriles plus (GEFS+) (Scheffer y Berkovic, 1997; Singh et al., 1999) .

Las IGE clásicas se dividen en una serie de subsíndromes clínicamente reconocibles pero superpuestos que incluyen epilepsia de ausencias de la niñez, epilepsia de ausencias juvenil, epilepsia mioclónica juvenil, etc. (Comisión de clasificación y terminología de la Liga Internacional contra la epilepsia, 1989; Roger et al., 1992) . Los subsíndromes se identifican por la edad de inicio y el patrón de los tipos de crisis (ausencia, mioclonía y tónicoclónicas) . Algunos pacientes, particularmente los que tienen solamente crisis tónico-clónicas no se ajustan a un subsíndrome específicamente reconocido. Los argumentos para considerar a éstos como síndromes separados, aun reconociendo que son parte de un continuo neurobiológico, han sido presentados previamente (Berkovic et al., 1987; 1994; Reutens y Berkovic, 1995) .

GEFS+ fue reconocida originalmente a través de grandes familias de múltiples generaciones y comprende una diversidad de subsíndromes. Las convulsiones febriles plus (FS+) es un subsíndrome en el que los niños tienen convulsiones febriles que ocurren fuera del rango de edad de 3 meses a 6 años, o tienen convulsiones tonicoclónicas febriles asociadas. Muchos miembros de la familia tienen un fenotipo indistinguible del síndrome de convulsiones febriles clásico y algunos tienen FS+ con crisis adicionales de ausencia, mioclónicas, atónicas o complejas parciales. El extremo grave del espectro de GEFS+ incluye la epilepsia mioclónica astática.

En las familias GEFS+, el análisis de ligamiento en las poco frecuentes grandes familias multigeneración con evidencia clínica de un gen autosómico dominante principal ha demostrado locus en los cromosomas 19q y 2q. Se han confirmado ambos locus GEFS+ 19q y 2q en familias numerosas comprobadas independientemente, y se identificaron defectos genéticos. Se conocen familias vinculadas a 19q y se identificó una mutación en el gen para la

subunidad β1 del canal neuronal del sodio (SCN1B) (Wallace et al., 1998) . Esta mutación da lugar a la pérdida de un puente disulfuro crítico de esta subunidad reguladora y provoca una pérdida de función in vitro. También se conocen familias vinculadas a 2q y se identificaron mutaciones en la subunidad α de formación del poro del canal neuronal del sodio (SCN1A) (PCT/AU01/01648; Escayg et al., 2000) .

La epilepsia mioclónica grave infantil (SMEI) se clasifica como un síndrome epiléptico que se manifiesta como crisis generalizadas y focales (parciales) (Comisión de clasificación y terminología de la Liga internacional contra la epilepsia, 1989) . La SMEI comienza con convulsiones hemiclónicas febriles y afebriles prolongadas y generalizadas en el primer año de vida. Entre el primero y los cuatro años de vida, evolucionan otros tipos de crisis incluidas las crisis mioclónicas, de ausencia y atónicas. El desarrollo neurológico es normal en la infancia con un enlentecimiento progresivo después de los dos años. A menudo existen antecedentes familiares de epilepsia y/o convulsiones febriles en pacientes con SMEI y un trabajo reciente ha demostrado que integrantes de la familia tienen fenotipos de epilepsia compatibles con el espectro de GEFS+ (Singh et al., 2001; Veggiotti, 2001) . Desde una perspectiva clínica, como GEFS+ y SMEI implican convulsiones relacionadas con fiebre, se pensó que los genes del canal del sodio podían ser el blanco para las mutaciones en individuos afectados por SMEI. Este hecho se confirmó más adelante cuando se identificaron mutaciones en el gen SCN1A en los pacientes con SMEI (Claes et al., 2001; Ohmori et al., 2002) . Es interesante que cada una de estas mutaciones fueron de novo, un hecho difícil de reconciliar basándose en la experiencia clínica de que un número significativo de casos de SMEI tiene antecedentes familiares de GEFS+.

Es importante desarrollar una prueba de diagnóstico molecular para ayudar al diagnóstico precoz de SMEI. Dicha prueba dirigiría la estrategia correcta de tratamiento para los pacientes que podrían verse afectados por SMEI y podría predecir el riesgo de agravamiento de las convulsiones debido a factores como la fiebre inducida por vacunación u otras causas. Los estudios clínicos para determinar la base molecular de la SMEI han sido variables en sus resultados y no han sido concluyentes en cuanto a una sola base molecular para la SMEI, particularmente dado que las alteraciones en el gen SCN1A están involucradas en otros subtipos de epilepsia. Los inventores han reconocido la necesidad de una prueba diagnóstica predictiva para la SMEI y por lo tanto, han creado un método que supera las limitaciones identificadas en los estudios clínicos anteriores y determina la probabilidad de que un paciente con epilepsia sufra de SMEI basándose en un análisis molecular del gen SCN1A.

Divulgación de la invención En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para diagnosticar predictivamente la probabilidad de que un paciente sufra de SMEI que comprende:

(i) secuenciar el gen SC1NA de un paciente con el fin de detectar una mutación en el gen SCN1A del paciente, incluida en una región reguladora del gen, en una muestra del paciente;

(ii) determinar si la mutación ha sido detectada previamente, o no, en el gen SCN1A de los sujetos y se sabe que está asociada a la SMEI, o no ha sido asociada previamente a la SMEI, donde, cuando la mutación identificada no ha sido asociada previamente a la SMEI, los padres o familiares del paciente también se... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar predictivamente la probabilidad de que un paciente sufra de SMEI que comprende:

(i) secuenciar el gen SC1NA de un paciente con el fin de detectar una mutación en el gen SCN1A del paciente, incluida en una región reguladora del gen, en una muestra del paciente;

(ii) determinar si la mutación ha sido detectada previamente, o no, en el gen SCN1A de los sujetos y se sabe que está asociada a la SMEI, o no ha sido asociada previamente a la SMEI, donde, cuando la mutación identificada no ha sido asociada previamente a la SMEI, los padres o familiares del paciente también se someten a análisis para determinar si la mutación del paciente ha surgido de novo.

donde dicho diagnóstico predictivo de riesgo de SMEI es de la manera siguiente:

(a) si la mutación ha sido asociada previamente a la SMEI, entonces se prevé una alta probabilidad de riesgo 15 de SMEI;

(b) si la mutación es conocida y no ha sido asociada previamente a la SMEI, entonces se prevé una baja probabilidad de riesgo de SMEI; y

(c) si la mutación no ha sido identificada previamente y se ha demostrado que ha surgido de novo, existe una

alta probabilidad de riesgo de SMEI y un riesgo aún mayor si la mutación se identifica como una mutación de 20 truncamiento.

2. El método reivindicado en la reivindicación 1 donde la mutación es una mutación identificada en la tabla 3.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 donde la muestra de ADN que se va a analizar se amplifica

cuantitativamente para al menos un exón del gen SCN1A a fin de producir fragmentos amplificados y la longitud de los productos de amplificación para cada exón amplificado se compara con la longitud de los productos de amplificación obtenidos cuando se amplifica un gen SCN1A silvestre utilizando los mismos cebadores, en virtud de lo cual diferencias en la longitud entre exón de la muestra amplificado y el exón silvestre amplificado correspondiente, reflejan que se produjo una alteración de truncamiento en el gen SCN1A de la muestra.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el paciente es un paciente epiléptico.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para auxiliar a una estrategia de 35 tratamiento correcta para el paciente.