MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA AVIDEZ DE ANTICUERPOS IgG.

Métodos para la Determinación de la Avidez de Anticuerpos IgG Antecedentes de la Invención Campo Técnico La presente invención se refiere a métodos para la determinación de la avidez de anticuerpos IgG anti-agentes infecciosos, por ejemplo, la avidez del anticuerpo IgG anti-citomegalovirus humano y anti-toxoplasma humano. Información Antecedente ES 2 366 050 T3 El Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que se clasifica entre los Coccidios. Este parásito tiene una gama de anfitriones relativamente amplia infectando tanto mamíferos como aves. El organismo es ubicuo en la naturaleza y existe en tres formas: taquizoitos, quistes, y ooquistes (Remington, J.S., McLeod, R., Desmonds, G., Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant (J.S. Remington y J.O. Klein, Eds.), págs. 140-267, Saunders, Filadelfia (1995)). Los taquizoitos encontrados durante la infección aguda, son la forma invasiva capaz de invadir todas las células de mamífero nucleadas. Después de la fase aguda de la infección, se forman los quistes tisulares llamados bradizoitos dentro de las células del anfitrión y persisten dentro del organismo del anfitrión durante la vida del anfitrión. Los quistes son importantes en la transmisión de la infección, especialmente en seres humanos, ya que la ingestión de carne cruda o poco cocinada puede dar como resultado la ingestión de bradizoitos, que pueden infectar al individuo dando como resultado una infección aguda. Los ooquistes representan una fase de la reproducción sexual, que se produce solamente en el revestimiento intestinal de la familia de los gatos desde el cual son excretados en las heces. La infección por T. gondii adquirida a través de carne contaminada o heces de gato en un adulto sano es a menudo asintomática. En mujeres embarazadas y en pacientes inmunodeprimidos, el resultado clínico puede ser muy grave. Una infección aguda con T. gondii adquirida durante el embarazo, especialmente durante el primer trimestre, puede dar como resultado la transmisión intrauterina al feto nonato produciendo graves complicaciones fetales y neonatales, incluyendo retraso mental y muerte fetal. El recrudecimiento de una infección por T. gondii previa o una infección aguda en un individuo inmunodeprimido puede resultar patogénica. La encefalitis toxoplásmica es la principal causa de morbidez y mortalidad en pacientes con SIDA. También se ha demostrado que la infección por Toxoplasma es una causa significativa de coriorretinitis en niños y adultos. La diagnosis de la infección con T. gondii se puede establecer por medio del aislamiento de T. gondii de la sangre o los fluidos corporales, demostración de la presencia del organismo en la placenta o tejidos del feto, demostración de la presencia del antígeno mediante detección de secuencias de ácido nucleico específicas (p. ej., sondas de ADN), o detección de inmunoglobulinas específicas de T. gondii sintetizadas por el anfitrión en respuesta a una infección utilizando ensayos serológicos. La detección de anticuerpos específicos de T. gondii y la determinación del título de anticuerpos son herramientas importantes utilizadas en la diagnosis de la toxoplasmosis. Las pruebas serológicas más ampliamente utilizadas para la diagnosis de la toxoplasmosis son la prueba del colorante de Sabin-Feldman (Sabin, A.B. y Feldman, H.A. (1948) Science 108, 660-663), la prueba de hemaglutinación indirecta (IHA) (Jacobs, L. y Lunde, M. (1957) J. Parasitol. 43, 308-314), la prueba de IFA (Walton, B.C. et al. (1966) Am. J. Trop. Med. Hyg. 15, 149-152), la prueba de aglutinación (Fondation Mérieux, Serologie de I'Infection Toxoplasmique en Particulier à Son Début: Méthodes et Interprétation des Resultants, Lyon, 182 págs. (1975)) y el ELISA (Naot, Y. y Remington, J.S. (1980) J. Infect. Dis. 142, 757-766). La prueba de ELISA es una de las pruebas más fáciles de realizar, y se encuentran disponibles en el mercado muchas pruebas serológicas automáticas para la detección de IgM e IgG específicas de Toxoplasma. Las pruebas actuales para la detección de los anticuerpos IgM e IgG en individuos afectados pueden variar ampliamente en cuanto a su capacidad para detectar anticuerpos en el suero. Por consiguiente, existe una variación significativa entre análisis entre los kits disponibles en el mercado. Las diferencias observadas entre los diferentes kits comerciales están causadas principalmente por la preparación del antígeno utilizado para la prueba serológica. La mayor parte de los kits utilizan taquizoitos o bien enteros o bien sometidos a sonicación desarrollados en cultivos de tejidos o en ratones, que contienen una elevada razón de material extra-parasítico, por ejemplo, células de mamífero, componentes para el cultivo de tejidos, etc. Debido a la carencia de un antígeno normalizado, purificado o de un método convencional para preparar el antígeno de taquizoitos, no es sorprendente que exista variabilidad entre análisis que dé como resultado análisis con diferentes características de funcionamiento en términos de sensibilidad y especificidad del análisis. Dadas las limitaciones de las pruebas serológicas que emplean el antígeno de taquizoitos, como se ha descrito antes, así como los problemas persistentes referentes a la determinación del comienzo de la infección, los antígenos 2 ES 2 366 050 T3 recombinantes purificados obtenidos por medio de la biología molecular son una alternativa atractiva ya que pueden ser purificados y normalizados. En la literatura, han sido clonados numerosos genes de Toxoplasma y expresados en un anfitrión adecuado para producir antígenos de Toxoplasma recombinantes, inmunorreactivos. Por ejemplo, P22 (SAG2), P24 (GRA1), P25, P28 (GRA2), P29 (GRA7), P30 (SAG1), P35 (GRA 8), P41 (GRA4), P54 (ROP2), P66 (ROP1) de Toxoplasma, y los antígenos P68 de Toxoplasma han sido descritos (Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43, 97-106; Cesbron-Delauw et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541; Johnson et al. (1991) Gene 99, 127-132; Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34, 3-13; Bonhomme et al. (1998) J. Histochem. Cytochem. 46, 1411-1421; Burg et al. (1988) J. Immunol. 141, 3584-3591; Knapp et al. (1989) EPA 431541A2; Carey et al. (2000) Molec. Biochem. Parasitol. 105, 25-37; Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-238; Saavedra et al. (1991) J. Immunol. 147, 1975-1982); EPA 751 147). Adicionalmente, se debe observar que la presencia de anticuerpos IgG en una única muestra de suero es suficiente para establecer que el paciente ha sido infectado pero no proporciona una indicación en cuanto a cuándo se produjo la infección. No obstante, en los Estados Unidos, no existe un programa de escrutinio serológico sistemático en mujeres embarazadas, mientras en países tales como Francia y Austria, se obtienen sueros a intervalos regulares a lo largo de la gestación en mujeres que son seronegativas cuando se someten al ensayo por primera vez. En los Estados Unidos, la decisión referente a si la mujer estuvo infectada recientemente, poniendo de ese modo en riesgo su feto, a menudo se toma a partir de los resultados de una única muestra de suero. No obstante, es crítico en las mujeres embarazadas determinar tan exactamente como sea posible si adquirieron su infección inmediatamente antes o durante el embarazo. Por esta razón, la presencia de anticuerpos IgG en una mujer embarazada a menudo conduce a una prueba serológica adicional para intentar determinar si la infección fue adquirida durante el embarazo o en un pasado lejano (Remington et al., 1995, Toxoplasmosis, 4 a ed., Coord. Ed., Remington, J.S., W.B. Saunders, Filadelfia, PA). De las pruebas serológicas adicionales recomendadas, aquellas que demuestran la presencia de anticuerpos IgM son las más frecuentemente utilizadas. No obstante, puesto que los anticuerpos IgM pueden seguir siendo detectables durante más de un año después de la infección inicial, la manifestación de estos anticuerpos no se puede utilizar para probar una infección recientemente adquirida (Liesenfeld et al., Journal of Clinical Microbiology 35:174-78 (1997); Wilson et al., Journal of Clinical Microbiology 35:3112-15 (1997); Wong et al., Clinical Infectious Diseases 18:853-62 (1994)). Debido a que la diagnosis exacta de la infección recientemente adquirida en mujeres embarazadas es importante para la gestión clínica tanto de la madre como de su feto, ha continuado la búsqueda de mejores métodos de diagnóstico (Remington et al., 1995, Toxoplasmosis, 4 a ed., Coord. Ed., J.S. Remington, W.B. Saunders, Filadelfia, PA; Wong et al., supra). El citomegalovirus humano (HCMV) es un miembro del grupo de herpes virus, es un agente ubicuo, y es responsable de un amplio espectro de enfermedades que afectan a los seres humanos en mucho entorno clínicos diferentes. Es raramente patógeno en adultos sanos pero... [Seguir leyendo]

1. Un método para la determinación de la proporción de anticuerpo IgG de baja avidez anti-agente infeccioso humano en una muestra del paciente, sospechoso dicho paciente de haber sido infectado por un agente infeccioso, que comprende las etapas de: a) añadir al menos un antígeno aislado de dicho agente infeccioso a una disolución para crear un antígeno en fase líquida y recubrir con dicho al menos un antígeno aislado una fase sólida para crear un antígeno en fase sólida; b) en un primer análisis, poner en contacto una muestra de ensayo de dicho paciente con una fase líquida que no comprende el antígeno infeccioso y después con dicha fase sólida recubierta de la etapa a) durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para la formación de complejos anticuerpo/antígeno para unir la IgG de alta y baja avidez a dicha fase sólida; c) lavar dicha fase sólida recubierta de la etapa b); d) en un segundo análisis, poner en contacto una muestra de ensayo de dicho paciente con dicho antígeno en fase líquida, esto es dicho antígeno en disolución y después con dicho antígeno en fase sólida durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para la formación de complejos anticuerpo/antígeno para unir la IgG de baja avidez a dicha fase sólida; e) lavar dicho antígeno en fase sólida puesto en contacto de la etapa d); f) añadir un producto conjugado a dichos primer y segundo análisis durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para la formación de complejos anti-IgG/anticuerpo/antígeno en dichos primer y segundo análisis, donde dicho producto conjugado comprende un anticuerpo anti-IgG anclado a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; g) detectar una señal generada por dicho compuesto generador de señal en dichos primer y segundo análisis; h) determinar la razón entre dicha señal obtenida en dicho segundo análisis y dicha señal obtenida en dicho primer análisis, donde dicha razón representa la proporción de anticuerpo IgG de baja avidez anti-agente infeccioso humano presente en dicha muestra del paciente; e i) multiplicar dicha razón de la etapa h) por 100 y restar dicha razón multiplicada de 100 con el fin de determinar el Índice de Avidez. 2. El método de la reivindicación 1, donde dicho agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en un virus, un parásito, un hongo y una bacteria. 3. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra del paciente se pretrata con una disolución antes de la adición de dicha fase sólida recubierta. 4. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha fase sólida se selecciona del grupo que consiste en un material poroso, un material no poroso, una partícula de látex, una partícula magnética, una micropartícula, una cuenta, una membrana, y un pocillo de microtitulación y un tubo de plástico. 5. El método de la reivindicación 1, donde el agente infeccioso es Toxoplasma gondii (T. gondii). 6. El método de la reivindicación 5, donde un Índice de avidez <20% indica que dicho paciente tiene una IgG para Toxoplasma de baja avidez, un Índice de avidez 50% indica que dicho paciente tiene una IgG para Toxoplasma de alta avidez, y un Índice de avidez entre 20% y 49% indica que dicho paciente es equívoco para la avidez del anticuerpo IgG para Toxoplasma. 7. El método de la reivindicación 5, donde un Índice de avidez < 30% indica que dicho paciente tiene una IgG para Toxoplasma de baja avidez, un Índice de avidez 40% indica que dicho paciente tiene una IgG para Toxoplasma de alta avidez, y un Índice de avidez entre 30% y 39% indica que dicho paciente es equívoco para la avidez del anticuerpo IgG para Toxoplasma. 8. El método de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, donde un resultado de IgG para Toxoplasma de baja avidez indica que dicho paciente puede tener o no toxoplasmosis aguda y un resultado de IgG para Toxoplasma de alta avidez indica que dicho paciente no ha tenido toxoplasmosis aguda en los aproximadamente 4 meses previos al ensayo. 9. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde dicho al menos un antígeno aislado de Toxoplasma gondii se selecciona del grupo que consiste en P22, P24, P25, P28, P29, P30, P35, P41, P54, P66 y P68. 10. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, donde dicha muestra del paciente se pretrata con una disolución antes de la adición de dicha fase sólida recubierta. 23 ES 2 366 050 T3 11. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, donde dicha fase sólida se selecciona del grupo que consiste en un material poroso, un material no poroso, una partícula de látex, una partícula magnética, una micropartícula, una cuenta, una membrana, un pocillo de microtitulación y un tubo de plástico. 12. El método de la reivindicación 1, donde el agente infeccioso es el citomegalovirus humano (HCMV). 13. El método de la reivindicación 12, donde un Índice de avidez < 40% indica que dicho paciente tiene una IgG para CMV de baja avidez, un Índice de avidez 70% indica que dicho paciente tiene una IgG para CMV de alta avidez, y un Índice de avidez entre 40% y 69% indica que dicho paciente es equívoco para la avidez del anticuerpo IgG para CMV. 14. El método de la reivindicación 12, donde un Índice de avidez < 50% indica que dicho paciente tiene una IgG para CMV de baja avidez, un Índice de avidez 60% indica que dicho paciente tiene una IgG para CMV de alta avidez, y un Índice de avidez entre 50% y 59% indica que dicho paciente es equívoco para la avidez del anticuerpo IgG para CMV. 15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde un resultado de IgG de baja avidez para CMV indica que dicho paciente tiene una infección por CMV primaria y un resultado de IgG de alta avidez para CMV indica que dicho paciente tiene una infección por CMV no primaria. 16. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde dicho al menos un antígeno aislado de citomegalovirus humano se selecciona del grupo que consiste en pp38, pp53, pp65, p130 y pp150. 17. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde dicha muestra del paciente se pretrata con una disolución antes de la adición de dicha fase sólida recubierta. 18. El método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde dicha fase sólida se selecciona del grupo que consiste en un material poroso, un material no poroso, una partícula de látex, una partícula magnética, una micropartícula, una cuenta, una membrana, un pocillo de microtitulación y un tubo de plástico. 24 ES 2 366 050 T3 Muestra de Paciente IgG+ IgM+ para CMV Selección del Protocolo de Dilución basado en el título de IgG para CMV ARCHITECT® (UA/ml) Análisis Núm. 1 Análisis Núm. 2 Pretratamiento de Pretratamiento de la Muestra la Muestra con Tampón Con Antígeno de CMV (Antígeno en Fase Líquida) Incubar con Micropartículas Recubiertas con Antígeno de CMV (Antígeno en Fase Sólida) Lavar las Micropartículas Análisis Núm. 1: Análisis Núm. 2 IgG para CMV de IgG para CMV de Alta y Baja Avidez Baja Avidez Unida a Antígeno Unida a Antígeno en Fase Sólida en Fase Sólida Incubar con Producto Conjugado anti-IgG humana de ratón marcada con acridinio Lavado y Adición de Pre-sensibilización y Sensibilización para la Generación de la Señal Eliminación de IgG para CMV de Alta Avidez ULR de la Muestra URL del Calibrador (Análisis Núm. 2) Índice de Avidez (%) = 100 - --------------------------------------------------------------------------------- X 100 ULR de la Muestra ULR del calibrador (Análisis Núm. 1) Figura 1 ES 2 366 050 T3 Muestra de Paciente IgG+ IgM+ para Toxoplasma Selección del Protocolo de Dilución basado en el título de IgG para Toxoplasma ARCHITECT® (UI/ml) Análisis Núm. 1 Análisis Núm. 2 Pretratamiento de Pretratamiento de la Muestra la Muestra con Tampón Con Antígeno para Toxoplasma (Antígeno en Fase Líquida) Incubar con Micropartículas Recubiertas con Antígeno para Toxoplasma (Antígeno en Fase Sólida) Lavar las Micropartículas 26 Eliminación de IgG para Toxoplasma de Alta Avidez Análisis Núm. 1: Análisis Núm. 2 IgG para Toxoplasma IgG para Toxoplasma de Alta y Baja Avidez de Baja Avidez Unida a Antígeno Unida a Antígeno en Fase Sólida en Fase Sólida Incubar con Producto Conjugado anti-IgG humana de ratón marcada con acridinio Lavado y Adición de Pre-sensibilización y Sensibilización para la Generación de la Señal ULR de la Muestra RLU del Calibrador (Análisis Núm. 2) Índice de Avidez (%) = 100 - --------------------------------------------------------------------------------- X 100 ULR de la Muestra RLU del calibrador (Análisis Núm. 1) Figura 2