Métodos de conversión intracelular de proteínas de cadena sencilla en su forma dicadena.

Un método intracelular para convertir una toxina clostridial de cadena sencilla que comprende una región de bucle dicadena en su forma dicadena,

comprendiendo el método las etapas de:

a) hacer crecer una célula que comprende una construcción de expresión dual a 37°C durante aproximadamente 3,5 horas, comprendiendo la construcción de expresión dual;

i) un marco de lectura abierta que codifica una toxina clostridial de cadena sencilla, comprendiendo la toxina clostridial de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión y una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y

ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV;

b) hacer crecer la célula a 22°C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas,

en donde el crecimiento a la etapa (b) induce la expresión de la toxina clostridial de cadena sencilla y la proteasa TEV a partir de la construcción de expresión dual; y

en donde la proteasa TEV producida escinde la toxina clostridial de cadena sencilla en el sitio de escisión de proteasa TEV situado en la región de bucle dicadena, convirtiendo así la toxina clostridial de cadena sencilla en su forma de dicadena.

Métodos de conversión intracelular de proteínas de cadena sencilla en su forma dicadena.

La capacidad de las toxinas clostridiales, tal como, por ejemplo, neurotoxinas botullnicas (BoNTs), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y neurotoxina tetánica (TeNT), para inhibir la transmisión neuronal se han explotado en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase por ejemplo, William J. Lipham, Cosmehc and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 24). Las toxinas clostridiales disponibles comercialmente como composiciones farmacéuticas incluyen, preparados de BoNT/A, tal como, por ejemplo, BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT®/RELOXIN®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Inglaterra), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) y XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania); y preparados de BoNT/B, tal como, por ejemplo, MYOBLOC/NEUROBLOC (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Como un ejemplo, BOTOX® está aprobado normalmente en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad adulta, fisura anal, dolor de espalda, blefarospasmo, bruxismo, distonía cervical, temblor esencial, lineas glabelares o lineas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas nasolabiales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno nerviosos Vil.

La utilidad terapéutica de toxinas clostridiales se ha expandido más allá de sus aplicaciones mio-relajantes habituales para tratar enfermedades basadas en nervio sensorial, tal como, por ejemplo, varias clases de dolor crónico, inflamación neurogénica y trastornos urogenitales, además de trastornos con base no neuronal, tal como, por ejemplo, pancreatitis. Una aproximación que se está explotando actualmente para expandir las terapias basadas en toxina clostridial implica modificar una toxina clostridial de manera que la toxina modificada tiene una capacidad de señalización celular alterada para una célula que no es diana de toxina clostridial. Esta capacidad re-dirigida se alcanza sustituyendo un dominio de señalización que se da de forma natural de una toxina clostridial con un dominio de señalización que muestra una actividad de unión selectiva por un receptor que no es de la toxina clostridial presente en una célula que no es diana de toxina clostridial. Dichas modificaciones a un dominio de señalización dan por resultado una toxina modificada que es capaz de unirse de forma selectiva a un receptor que no es de la toxina clostridial (receptor diana) presente en una célula que no es diana de toxina clostridial (re-dirigida). Una toxina clostridial re-dirigida con una actividad de señalización para una célula que no es diana de la toxina clostridial puede unirse a un receptor presente en la célula que no es diana de la toxina clostridial, translocarse en el citoplasma y ejercer su efecto proteolítico en el complejo SIMARE de la célula que no es diana de la toxina clostridial.

Ejemplos no limitantes de toxinas clostridiales re-dirigidas con una actividad de señalización para una célula que no es diana de la toxina clostridial se describen en, por ejemplo, Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Patente de EE.UU. 5.989.545; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, Patente de EE.UU. 6.461.617; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente de EE.UU. 6.5.436; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds forthe Treatment of Mucus Hypersecretion, Patente de EE.UU. 6.632.44; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, Patente de EE.UU. 6.843.998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente de EE.UU. 7.419.676; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Patente de EE.UU. 7.514.88; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, Publicación de Patente de EE.UU. 23/18289; y Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, Publicación de Patente Internacional WO 25/2339. La capacidad para re-dirigir los efectos terapéuticos asociados con las toxinas clostridiales ha extendido enormemente el número de aplicaciones medicinales capaces de usar una terapia de toxina clostridial. Como un ejemplo no limitante, las toxinas clostridiales modificadas redirigidas a neuronas sensoras son útiles en el tratamiento de varias clases de dolor crónico, tal como, por ejemplo, hiperalgesia y alodinia, dolor neuropático y dolor inflamatorio, véase, por ejemplo, Foster, supra, (1999); y Donovan, supra, (22); y Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components, Patente de EE.UU. 7.22.329. Como otro ejemplo no limitante, las toxinas clostridiales modificadas redirigidas a células pancreáticas son útiles en el tratamiento de pancreatitis, véase, por ejemplo, Steward, supra, (25).

Las toxinas clostridiales, si se dan de forma natural o modificada, se procesan en una forma dicadena para alcanzar la actividad total. Las toxinas clostridiales que se dan de forma natural se traducen cada una como un polipéptido de cadena sencilla de aproximadamente 15 kDa que se escinde posteriormente por escisión proteolítica en un bucle disulfuro mediante una proteasa que se da de forma natural (FIG. 1). Esta escisión se da en la región de bucle dicadena discreta creada entre dos residuos cisterna que forman un puente disulfuro. Este procesado post- traduccional da una molécula dicadena que comprende una cadena ligera de aproximadamente 5 kDa (CL), que comprende el dominio enzimático, y una cadena pesada de aproximadamente 1 kDa (CP), que comprende los dominios de translocación y unión celular, manteniéndose la CL y la CP juntas mediante el enlace disulfuro sencillo e interacciones no covalentes (FIG. 1). Las toxinas clostridiales producidas de forma recombinante sustituyen generalmente el sitio de escisión de proteasa del bucle dicadena que se da de forma natural con un sitio de escisión de proteasa exógena (FIG. 2). Véase, por ejemplo, Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Patente de EE.UU. 7.419.676. Aunque las toxinas clostridiales re-dirigidas varían en su peso molecular total por el tamaño del resto de señalización, el proceso de activación y su dependencia de los sitios de escisión exógenos es

esencialmente el mismo que el de las toxinas clostridiales producidas de forma recombinante. Véase, por ejemplo, Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Publicación de Patente de EE.UU. 29/5313; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non- Clostridial Toxin Target Cells, Solicitud de Patente de EE.UU. 11/776.75; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Publicación de Patente de EE.UU. 28/241881.

Hasta la fecha, la conversión de la forma de cadena sencilla de una toxina clostridial producida de forma recombinante o toxina clostridial modificada en su forma dicadena requirió un proceso de activación in vitro. Primero, las células bacterianas usadas para producir de forma recombinante estas toxinas carecen de la proteasa que se da de forma natural presente en las cepas clostridiales que producen las toxinas nativas. Segundo, no ha habido gran necesidad de que las células bacterianas produzcan toxinas activadas de forma recombinante por preocupaciones de seguridad surgidas en el manejo de toxinas activadas. Véase, por ejemplo, Dolly, U.S. 7.419.676, supra, (28). Sin embargo, si estas preocupaciones pudieran superarse, la producción de toxinas activadas producidas de forma recombinante modernizarían el proceso de fabricación de toxinas clostridiales producidas de forma recombinante o toxinas clostridiales modificadas. Por ejemplo, actualmente la fabricación de toxinas clostridiales producidas de forma recombinante o toxinas clostridiales modificadas implica las siguientes etapas de purificación: 1) cromatografía de afinidad por metales inmovilizados, 2) diálisis de intercambio detampón, 3) reacción de escisión de proteasa, 4), cromatografía de intercambio iónico y 5) adición de PEG y congelación rápida por almacenamiento a -8°C. El uso de una célula bacteriana que puede escindir proteolíticamente la toxina clostridial recombinante de forma intracelular mientras está aún expresando la toxina puede reducir el número de etapas de purificación a las siguientes:... [Seguir leyendo]

1. Un método intracelular para convertir una toxina clostridial de cadena sencilla que comprende una región de bucle dicadena en su forma dicadena, comprendiendo el método las etapas de:

a) hacer crecer una célula que comprende una construcción de expresión dual a 37°C durante aproximadamente 3,5 horas, comprendiendo la construcción de expresión dual;

i) un marco de lectura abierta que codifica una toxina clostridial de cadena sencilla, comprendiendo la toxina clostridial de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión y una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y

ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV;

b) hacer crecer la célula a 22°C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas,

en donde el crecimiento a la etapa (b) induce la expresión de la toxina clostridial de cadena sencilla y la proteasa TEV a partir de la construcción de expresión dual; y

en donde la proteasa TEV producida escinde la toxina clostridial de cadena sencilla en el sitio de escisión de proteasa TEV situado en la región de bucle dicadena, convirtiendo así la toxina clostridial de cadena sencilla en su forma de dicadena.

2. Un método intracelular para convertir una proteína de cadena sencilla en su forma dicadena, comprendiendo el método las etapas de

a) hacer crecer una célula que comprende una construcción de expresión dual a 37°C durante aproximadamente 8 horas, comprendiendo la construcción de expresión dual;

i) un marco de lectura abierta que codifica una proteína de cadena sencilla, comprendiendo la proteína de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y

ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV;

b) hacer crecer la célula a aproximadamente 12 a aproximadamente 16°C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas,

en donde el crecimiento a la etapa (b) induce la expresión de la proteína de cadena sencilla y la proteasa TEV a partir de la construcción de expresión dual; y

en donde la proteasa TEV producida escinde la proteína de cadena sencilla en el sitio de escisión de proteasa TEV situado en el dominio de unión opioide al sitio de escisión TEV integrado, convirtiendo así la proteína de cadena sencilla en su forma dicadena.

3. Un método intracelular para convertir una proteína de cadena sencilla en su forma dicadena, comprendiendo el método las etapas de

a) hacer crecer una célula que comprende una construcción de expresión dual a 37°C durante aproximadamente 8 horas, comprendiendo la construcción de expresión dual;

i) un marco de lectura abierta que codifica una proteína de cadena sencilla, comprendiendo la proteína de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión que no es de toxina clostridial y una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y

¡i) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV;

b) hacer crecer la célula a aproximadamente 12 a aproximadamente 16°C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas,

en donde el crecimiento a la etapa (b) induce la expresión de la proteína de cadena sencilla y la proteasa TEV a partir de la construcción de expresión dual; y

en donde la proteasa TEV producida escinde la proteína de cadena sencilla en el sitio de escisión de proteasa TEV situado en la región de bucle dicadena, convirtiendo así la proteína de cadena sencilla en su forma dicadena.

4. Una construcción de expresión dual que comprende:

i) un marco de lectura abierta que codifica una toxina clostridial de cadena sencilla, comprendiendo la toxina clostridial de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión y una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y

ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV.

5. Una construcción de expresión dual que comprende:

i) un marco de lectura abierta que codifica una proteína de cadena sencilla, comprendiendo la proteína de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y

ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV.

6. Una construcción de expresión dual que comprende:

i) un marco de lectura abierta que codifica una proteína de cadena sencilla, comprendiendo la proteína de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión que no es de toxina clostridial y una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y

ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV.