Un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN recombinando al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN,

donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato difieren entre sí en al menos dos posiciones de nucleótidos y cada una comprende una pluralidad de segmentos definidos, comprendiendo el método: (a) proporcionar un grupo de cebadores oligonucleotídicos puente, que comprende al menos un cebador para cada hebra de cada uno de la pluralidad de segmentos definidos, donde la secuencia del cebador es complementaria a al menos una unión con otro segmento definido; (b) amplificar los segmentos definidos de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN con los cebadores de la etapa (a) en una reacción en cadena de la polimerasa; (c) ensamblar los productos de la etapa (b) para generar una genoteca diversa de moléculas sustrato de ADN recombinantes; (d) escrutar o seleccionar las proteínas codificadas por los productos de la etapa (c) en busca de una propiedad deseada; y (e) recuperar al menos una molécula sustrato de ADN recombinante de la etapa (d) que codifica una proteína desarrollada

Antecedentes de la Invención

La recombinación repetitiva de secuencias supone realizar ciclos iterativos de recombinación y escrutinio 5 o selección para "desarrollar" genes individuales, plásmidos completos o virus, agrupaciones de múltiples genes, o incluso genomas completos (Stemmer, Bio/Technnology 13:549-553 (1995)). Tales técnicas no requieren el análisis y la computación exhaustivos 10 requeridos por los métodos convencionales para la ingeniería de polipéptidos. La recombinación repetitiva de secuencias permite la recombinación de un gran número de mutaciones en un número mínimo de ciclos de selección, en contraste con los eventos de recombinación por pares, tradicionales.

De este modo, las técnicas de recombinación

repetitiva de secuencias (RSR) proporcionan ventajas

concretas ya que proporcionan la recombinación entre mutaciones en todas o cada una de éstas, proporcionado de así un modo muy rápido de explorar la manera en la cual diferentes combinaciones de mutaciones pueden afectar a un resultado deseado.

25 En algunos casos, no obstante, se encuentra disponible información estructural y/o funcional que, aunque no se requiere para la recombinación repetitiva de secuencias, proporciona oportunidades para la modificación de la técnica. En otros casos, la selección y/o el escrutinio de un gran número de recombinantes pueden ser costosos o llevar mucho tiempo. Un problema adicional puede ser la manipulación de moléculas grandes de ácido nucleico. La presente invención trata estas y otras cuestiones.

El documento WO 95/22625 describe métodos para desarrollar polinucleótidos o polipéptidos con una propiedad funcional deseada basándose en la fragmentación al azar de polinucleótidos molde, seguido de ciclos múltiples de desnaturalización, renaturalización e incubación en presencia de una polimerasa, y el escrutinio o selección para identificar un polinucleótido que tiene una propiedad funcional deseada.

Compendio de la Invención

La invención proporciona un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN recombinando al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato difieren entre sí en al menos dos posiciones de nucleótidos y cada una comprende una pluralidad de segmentos definidos, comprendiendo el método:

1. (a) proporcionar un grupo de cebadores oligonucleotídicos puente, que comprende al menos un cebador para cada hebra de cada uno de una pluralidad de segmentos definidos, donde la secuencia del cebador es complementaria a al menos un empalme con otro segmento definido;

2.(b) amplificar los segmentos definidos de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN con los cebadores de la etapa (a) en una reacción en cadena de la polimerasa;

3. (c) ensamblar los productos de la etapa (b) para generar una genoteca diversa de moléculas sustrato de ADN recombinante;

4. (d) escrutar o seleccionar las proteínas codificadas por los productos de la etapa (c) en busca de una

propiedad deseada; y

5. (e) recuperar al menos una molécula sustrato de ADN recombinante de la etapa (d) que codifica una proteína desarrollada.

Otros rasgos de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN que comprende:

1. (a) digerir al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato difieren entre sí en al menos un nucleótido, con una endonucleasa de restricción;

2. (b) ligar la mezcla para generar una genoteca de moléculas de ADN recombinante;

3. (c) escrutar o seleccionar los productos de la etapa (b) en busca de una propiedad deseada; y

4. (d) recuperar una molécula sustrato de ADN recombinante que codifica una proteína desarrollada.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN recombinando al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato difieren entre sí en al menos un nucleótido y comprenden segmentos definidos, comprendiendo el método:

1. (a) proporcionar un grupo de cebadores oligonucleotídicos de PCR, que comprende al menos un cebador para cada segmento, donde la secuencia del

cebador es complementaria a al menos un empalme con otro segmento;

2. (b) amplificar los segmentos de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN con los cebadores de la etapa (a) en una reacción en cadena de la polimerasa;

3. (c) ensamblar los productos de la etapa (b) para generar una genoteca de moléculas sustrato de ADN recombinantes;

4. (d) escrutar o seleccionar los productos de la etapa

(c) en busca de una propiedad deseada; y

5. (e) recuperar una molécula sustrato de ADN recombinante de la etapa (d) que codifica una proteína desarrollada.

También se describe en la presente memoria un método de enriquecimiento de una población de fragmentos de ADN en secuencias mutantes que comprende:

1. (a) desnaturalizar y renaturalizar la población de fragmentos para generar una población de fragmentos de doble hebra híbridos en los que al menos un fragmento de doble hebra comprende al menos un emparejamiento erróneo de un par de bases;

2. (b) fragmentar los productos de la etapa (a) en fragmentos de aproximadamente 20-100 pb;

3. (c) purificar por afinidad los fragmentos que tienen un emparejamiento erróneo sobre una matriz de afinidad para generar una reserva de fragmentos de ADN enriquecidos en secuencias mutantes; y

4. (d) ensamblar los productos de la etapa (c) para generar una genoteca de moléculas sustrato de ADN recombinante.

También se describe en la presente memoria un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN, recombinando al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato comparten una región de homología de la secuencia de aproximadamente 10 a 100 pares de bases y comprenden segmentos definidos, comprendiendo el método:

1. (a) proporcionar regiones de homología en las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN insertando una secuencia intrónica entre al menos dos segmentos definidos;

2. (b) fragmentar y recombinar las moléculas sustrato de ADN recombinante de la etapa (a), donde las regiones de homología están proporcionadas por los intrones;

3. (c) escrutar o seleccionar los productos de la etapa

(b) en busca de una propiedad deseada; y

4. (d) recuperar una molécula sustrato de ADN recombinante a partir de los productos de la etapa

(c) que codifican una proteína desarrollada.

También se describe en la presente memoria un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN recombinando al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato difieren entre sí en al menos un nucleótido y comprenden segmentos definidos, comprendiendo el método:

1. (a) proporcionar un grupo de cebadores de PCR oligonucleotídicos, donde para cada hebra de cada segmento se proporciona un par de cebadores, puenteando un miembro de cada par la unión en un extremo del segmento y puenteando el otro la unión en el otro extremo del segmento, teniendo los extremos terminales de la molécula de ADN como miembro del par un cebador genérico, y donde se proporciona un grupo de cebadores para cada una de las al menos primera y segunda moléculas sustrato;

2. (b) amplificar los segmentos de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN con los cebadores de la etapa (a) en una reacción en cadena de la polimerasa;

3. (c) ensamblar los productos de la etapa (b) para generar una reserva de moléculas de ADN recombinantes;

4. (d) seleccionar o escrutar los productos de la etapa

(c) en busca de una propiedad deseada; y

5. (e) recuperar una molécula sustrato de ADN recombinante de los productos de la etapa (d) que codifica una proteína desarrollada.

También se describe en la presente memoria un método para optimizar la expresión de una proteína desarrollando la proteína, donde la proteína está codificada por una molécula sustrato de ADN, que comprende:

1....

1. Un método para desarrollar una proteína codificada por una molécula sustrato de ADN recombinando al menos una primera y una segunda moléculas sustrato de ADN, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato difieren entre sí en al menos dos posiciones de nucleótidos y cada una comprende una pluralidad de segmentos definidos, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un grupo de cebadores oligonucleotídicos puente, que comprende al menos un cebador para cada hebra de cada uno de la pluralidad de segmentos definidos, donde la secuencia del cebador es complementaria a al menos una unión con otro segmento definido;

(b) amplificar los segmentos definidos de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN con los cebadores de la etapa (a) en una reacción en cadena de la polimerasa;

(c) ensamblar los productos de la etapa (b) para generar una genoteca diversa de moléculas sustrato de ADN recombinantes;

(d) escrutar o seleccionar las proteínas codificadas por los productos de la etapa (c) en busca de una propiedad deseada; y

(e) recuperar al menos una molécula sustrato de ADN recombinante de la etapa (d) que codifica una proteína desarrollada.

2. El método de la reivindicación 1, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN se someten a mutagénesis antes de la etapa (a).

3. El método de la reivindicación 1, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN comprenden alelos de un gen.

4. El método de la reivindicación 1, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN comprenden una genoteca de mutantes.

5. El método de la reivindicación 1, donde los segmentos se definen por los sitios de las regiones intergénicas.

6. El método de la reivindicación 1, donde los segmentos se definen por los sitios de los intrones.

7. El método de la reivindicación 1, donde los cebadores comprenden una sustitución de uracilo en uno o más de los residuos de timidina.

8. El método de la reivindicación 7, donde los productos de la etapa (b) se tratan con uracilo glicosilasa.

9. El método de la reivindicación 1, donde se repiten las etapas (a) -(e).

10. El método de la reivindicación 1, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN comprenden cada una una agrupación de genes.

11. El método de la reivindicación 1, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN codifican cada una toda o parte de una ADN polimerasa.

12. El método de la reivindicación 1, donde al menos un cebador difiere de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN en al menos un nucleótido.

13. El método de la reivindicación 12, donde el cebador comprende una secuencia de nucleótidos de un mutante o polimorfismo de las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN.

14. El método de la reivindicación 13, donde el cebador es degenerado y codifica las secuencias de nucleótidos de más de un mutante o polimorfismo de las al menos primera o segunda moléculas sustrato de ADN.

15. El método de la reivindicación 14, donde las al menos primera y segunda moléculas sustrato de ADN codifican cada una toda o una parte de una proteína seleccionada de la Tabla I o interferón alfa.

16. El método de la reivindicación 2, donde la mutagénesis comprende la recombinación repetitiva de secuencias.

17. El método de la reivindicación 1, donde los productos de la etapa (e) se someten a mutagénesis para producir moléculas sustrato de ADN recombinantes.

18. El método de la reivindicación 17, donde la mutagénesis comprende la recombinación repetitiva de secuencias.

19. El método de la reivindicación 17, donde las moléculas sustrato de ADN recombinantes mutagenizadas se utilizan en la etapa (b).

20. El método de la reivindicación 1, donde la molécula sustrato de ADN recombinante de la etapa (e) se utiliza como molécula sustrato de ADN en la etapa (b).

5 21. El método de la reivindicación 1, donde la molécula sustrato de ADN recombinante de la etapa (e) comprende una genoteca de moléculas sustrato de ADN recombinantes.

10 22. El método de la reivindicación 1, donde la genoteca comprende más de 105 miembros.