MÉTODOS, COMPOSICIONES Y ENSAYOS DE COMPUESTOS PARA INHIBIR LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA BETA-AMILOIDE.

Un método para identificar un compuesto que inhibe el procesamiento de la proteína precursora de β

-amiloide en una célula de mamífero, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto con un polipéptido que com- prende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 4, 289 a 303; y (b) medir el nivel de un péptido β-amiloide

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Campo de la Invención

Esta invención se refiere al campo de los trastornos de las células neuronales de mamíferos, y, en particular, a métodos para identificar compuestos eficaces útiles para la prevención y el tratamiento de enfermedades asociadas a la pérdida progresiva de la capacidad intelectual en seres humanos.

El trastorno neurológico más conocido por su pérdida progresiva de capacidad intelectual es la enfermedad de Alzheimer (EA). En todo el mundo, alrededor de 20 millones de personas padecen la enfermedad de Alzheimer. La EA se caracteriza clínicamente por la pérdida inicial de memoria, seguida por desorientación, deterioro del juicio y del razonamiento, que se denomina habitualmente deterioro cognitivo, y finalmente por la demencia completa. Los pacientes de EA caen finalmente en un estado inmóvil, gravemente debilitado, entre cuatro y doce años tras el inicio de la enfermedad.

La prueba patológica clave de EA es la presencia de placas amiloides extracelulares y ovillos intracelulares de proteína tau en el cerebro, que están asociados a la degeneración neuronal (Ritchie y Lovestone (2002)). Se cree que las placas amiloides extracelulares son el resultado de un incremento del péptido º-amiloide 1-42 insoluble producido por el metabolismo de la proteína precursora de º-amiloide (APP). Tras la secreción, estos péptidos º-amiloides 1-42 forman fibrillas amiloides más fácilmente que los péptidos º-amiloides 1-40, que se producen predominantemente en las personas sanas. Parece que el péptido º-amiloide está en lo alto de la cascada neurotóxica: los experimentos demuestran que las fibrillas º-amiloides, cuando se inyectan en los cerebros de ratones transgénicos P301L tau, estimulan la formación de ovillos neurofibrilares (Gotz et al. (2001)). De hecho, una variedad de péptidos º-amiloides se ha identificado como péptidos º-amiloides 1-42, 1-40, 1-39, 1-38, 1-37, que se pueden hallar en las placas y que se observan a menudo en el líquido cefalorraquídeo.

Los péptidos º-amiloides se generan (o se procesan) a partir de la APP anclada a la membrana, tras la escisión mediante una º-secretasa y una º-secretasa en la posición 1 y 40 ó 42, respectivamente (Figura 1A) (Annaert y De Strooper (2002)). Además, la actividad elevada de la º-secretasa da como resultado un desplazamiento de la escisión de la posición 1 a la posición 11. La escisión de la proteína precursora de º-amiloide mediante la actividad de la º-secretasa en la posición 17 y mediante la actividad de la º-secretasa en 40 ó 42 genera el péptido p3 no patológico. La º-secre-tasa se identificó como la aspartil proteasa BACE anclada a membranas, mientras la ºsecretasa es un complejo proteico que comprende presenilina 1 (PS1) o presenilina 2 (PS2), nicastrina, proteína deficiente de faringe anterior 1 (APH1) y estimulador de presenilina 2 (PEN2). De estas proteínas, se considera de forma generalizada que las presenilinas constituyen la actividad catalítica de la º-secretasa, mientras los otros componentes desempeñan un papel en la maduración y la localización del complejo. La identidad de la º-secretasa es todavía dudosa, aunque algunos resultados apuntan hacia las proteasas ADAM 10 y TACE, que podrían tener funciones redundantes.

Una pequeña fracción de casos de EA (en su mayor parte EA de inicio temprano) están provocados por mutaciones autosómicas dominantes en los genes que codifican las presenilinas 1 y 2 (PS1; PS2) y la proteína precursora de º-amiloide (APP), y se ha demostrado que las mutaciones en APP, PS1 y PS2 alteran el metabolismo de la proteína precursora de º-amiloide, lo que conduce a tales niveles incrementados de º-amiloide 1-42 producido en el cerebro. Aunque no se han identificado mutaciones en PS1, PS2 y la proteína precursora de º-amiloide en los pacientes de EA de inicio tardío, las características patológicas son sumamente similares a las de los pacientes de EA de inicio temprano. Estos niveles incrementados de péptido ºamiloide se podrían originar de manera progresiva con la edad a partir de un procesamiento alterado de la proteína precursora de º-amiloide (p.ej. los niveles elevados de colesterol incrementan la producción del péptido º-amiloide) o a partir de un catabolismo disminuido del péptido º-amiloide. Por lo tanto, está aceptado en general que la EA en pacientes de EA de inicio tardío está provocada también por niveles anormales incrementados de péptido amiloide en los cerebros. El nivel de estos péptidos º-amiloides, y más en particular del péptido º-amiloide 1-42, está incrementado en los pacientes de Alzheimer en comparación con los niveles de estos péptidos en personas sanas. Así, es probable que la reducción de los niveles de estos º-amiloides sea beneficiosa para los pacientes con deterioro cognitivo.

Merchiers et al. (2003) (Soc Neurosci Abs) describe el cribado de alto rendimiento basado en células para la identificación de genes supuestamente susceptibles al tratamiento con fármacos que modifiquen la enfermedad de Alzheimer, que modulan los niveles de amiloide. Entre los genes de procesamiento de APP, también se identifican 3 nuevos receptores acoplados a proteína G que modulan el procesamiento de APP.

Eggerickx et al. (1995) (Biochem J, 309, 837-843) describe la expresión de GPR3 en el cerebro.

Desarrollos Informados

Las principales terapias actuales para la EA se limitan a retrasar la pérdida progresiva de memoria inhibiendo la enzima acetilcolinesterasa, lo que incrementa los niveles del neurotransmisor acetilcolina, lo cual falla debido a que las neuronas colinérgicas son las primeras neuronas en degenerar durante la EA. Esta terapia no detiene la progresión de la enfermedad.

Se están investigando cada vez más las terapias dirigidas a disminuir los niveles de los péptidos º-amiloides en el cerebro y se centran en el procesamiento alterado de la proteína precursora de º-amiloide que implica a las enzimas º-o º-secretasas.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que ciertos polipéptidos conocidos son factores en la estimulación y/o la inducción del procesamiento del precursor º-amiloide en las células neuronales, y que la inhibición de la función de tales polipéptidos es eficaz en la reducción de los niveles de los péptidos º-amiloides.

Sumario de la Invención

La presente invención se refiere a la relación entre la función de el/los receptor(es) acoplado(s) a proteína G ("GPCR(s)") y el procesamiento de la proteína precursora de º-amiloide en las células de mamíferos.

Un aspecto de la presente invención es un método para identificar un compuesto que inhibe el procesamiento de una proteína precursora de º-amiloide en una célula de mamífero, tal como se define en la reivindicación 1.

Los aspectos del presente método incluyen el ensayo in vitro de compuestos mediante el uso de dominios polipeptídicos del GPCR, y ensayos celulares en los que se sigue la inhibición de GPCR observando indicadores de eficacia, que incluyen los niveles de segundos mensajeros y/o los niveles de péptido º-amiloide.

Se describe un método de tratamiento o prevención de una afección que implica deterioro cognitivo, o una susceptibilidad a la afección, en un sujeto que padece o que es susceptible a ello, administrando una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de GPCR o agonista inverso que inhibe el procesamiento del precursor º-amiloide.

Se describe una composición farmacéutica para el uso en dicho método, en el que dicho inhibidor comprende un polinucleótido seleccionado del grupo de un polinucleótido inverso, una ribozima, y un ARN pequeño de interferencia (siARN), en el que dicho agente comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a, o modificada a partir de, una secuencia polinucleotídica natural que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 4-6.

Se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista o agonista inverso de GPCR o una sal, hidrato, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo que inhibe el procesamiento del precursor º-amiloide, mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de polinucleótidos...

1. Un método para identificar un compuesto que inhibe el procesamiento de la proteína precursora de º-amiloide en una célula de mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 4, 289 a 303; y

(b) medir el nivel de un péptido º-amiloide.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido está asociado a membranas.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido está presente en un receptor celular transmembrana en una célula de mamífero.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho método comprende además la etapa de medir la activación de una ruta biológica que produce un indicador del procesamiento de la proteína precursora de º-amiloide, en el que dicho indicador es un segundo mensajero.

5. El método en la reivindicación 4, en el que dicho segundo mensajero es AMP cíclico o Ca2+ .

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho péptido º-amiloide se selecciona del grupo que consiste en uno o más de los péptidos

º-amiloides 1-42, 1-40, 11-42 y 11-40.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho péptido º-amiloide es el péptido º-amiloide 1-42.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho método comprende además la etapa de medir la expresión de un indicador en dicha célula de mamífero.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el indicador se selecciona del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, GFP, eGFP, dGFP, luciferasa y º-galactosidasa.

5 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en los compuestos de una biblioteca de cribado disponible comercialmente.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho compuesto es un péptido de una biblioteca de expresión en fagos o una biblioteca de fragmentos de anticuerpos.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho

compuesto es una ariloxiditiourea, sus sales, hidratos, o solvatos. 15