Métodos y agentes para inmunomodulación y métodos para identificar inmunomoduladores.

Uso de un agente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inmune causado o agravado por una activación anormal de NF-kB a través de la vía canónica,

en donde dicho agente es un anticuerpo capaz de unirse a las coordinadas de aminoácidos 123-175 de SIVA1 (SEQ ID NO: 3) o a las coordenadas de aminoácidos 58-110 de SIVA2 (SEQ ID NO: 4), una molécula de ARN pequeño de interferencia o una ribozima en donde el ARN pequeño de interferencia o la ribozima regula a la baja el gen diana SIVA.

Mïtodos y agentes para inmunomodulaciïn y mïtodos para identificar inmunomoduladores Campo de la invenciïn La presente descripciïn se refiere a mïtodos para regular una respuesta inmune en un individuo. Mïs particularmente, la presente invenciïn se refiere a agentes que se dirigen a NIK y a proteïnas que se unen a NIK que participan en la vïa canïnica de activaciïn de NF-κB, para uso en el tratamiento de un trastorno inmune y a mïtodos para identificar molïculas/agentes que disminuyen la actividad de NIK.

Antecedentes de la invenciïn La familia de factores de transcripciïn NF-κB/Rel estï activa en la respuesta inflamatoria e inmune celular, en la regulaciïn del ciclo celular, la diferenciaciïn y la protecciïn contra la apoptosis [Baeuerle y Baltimore, Cell, 87:13-20, (1996) ; Ghosh, et al, Annu. Rev. Immunol. 16:225-260, (1998) ]. En los mamïferos, esta familia de factores de transcripciïn estï compuesta por cinco miembros: p65 (RelA) , RelB, c-Rel, NF-κB1 (que se produce como precursor, p105, y en una forma procesada, p50) y NF-κB2 (que se produce como un precursor, p100, y como su producto procesado, p52) . Los homodïmeros y heterodïmeros de la proteïna NF-κB existen en el citoplasma, formando un complejo con inhibidores de la familia IκB. Las formas precursoras de NF-κB1 y NF-κB2 (p105 y p100, respectivamente) contienen regiones inhibidoras de homïlogos de IκB C-terminales. Los dïmeros que contienen estas proteïnas NF-κB son retenidos en el citoplasma debido a la funciïn de las regiones homïlogas a IκB. Ademïs NFκB1/p105 y NF-κB2/p100 tambiïn se pueden asociar con dïmeros de otras proteïnas NF-κB y forzar una retenciïn citoplasmïtica sobre ellos. La activaciïn de NF-κB se produce principalmente a travïs de la degradaciïn inducida de las proteïnas IκB o de regiones homïlogas a IκB en NF-κB1/p105 y NF-κB2/p100, y la consiguiente la translocaciïn de los dïmeros de NF-κB al nïcleo. La degradaciïn inducida de las proteïnas IκB proporciona el mecanismo mïs importante para regular la actividad de NF-κB (Baeuerle y Baltimore, 1996) (Ghosh et al., 1998) (Ghosh y Karin, 2002) .

La mayor parte del conocimiento que se tiene sobre estos procesos se refiere a los mecanismos de activaciïn de un dïmero de NF-κB ubicuo, p65:p50. El evento decisivo que inicia esta vïa “canïnica” es la activaciïn de una proteïna cinasa que fosforila IκB, IKK2. IKK2 estï presente dentro de un complejo macromolecular, el “seïalosoma IKK”, junto con una cinasa estructuralmente homïloga, IKK1, y una proteïna adaptadora, NEMO. La fosforilaciïn mediada por IKK2 de IκB conduce a su degradaciïn proteasïmica y, por lo tanto, a la activaciïn de sus dïmeros de NF-κB asociados (Karin y Ben-Neriah, 2000) .

Otros estudios han arrojado algo de conocimiento sobre una vïa “alternativa” a travïs de la cual los dïmeros de NFκB que contienen NF-κB2/p100 se activan. Esta activaciïn se produce con independencia de IKK2 o NEMO, pero depende de IKK1. La fosforilaciïn de p100 despuïs de la activaciïn de esta vïa, conduce a un procesamiento proteolïtico limitado en el que solo se degrada la regiïn homïloga de IκB dentro de p100. Este proceso permite que el fragmento p52 resultante sufra una translocaciïn al nïcleo en asociaciïn con algunas otras proteïnas NF-κB (principalmente RelB) (Xiao et al., 2001) (Senftleben et al., 2001) (Solan et al., 2002) (Coope et al., 2002) (Claudio et al., 2002) (Kayagaki et al., 2002) (Dejardin et al., 2002) (Yilmaz et al., 2003) (Hatada et al., 2003) .

Las proteïnas de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral/factor de crecimiento nervioso (TNF/NGF) son un grupo de receptores de la superficie celular implicados de forma decisiva en el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune. Estas proteïnas interaccionan con sus ligandos correspondientes, ya sea para inducir la muerte celular o para impulsar la supervivencia celular de las cïlulas inmunes. La funciïn biolïgica de este grupo de proteïnas se ha asociado estrechamente con la regulaciïn de la respuesta inmune y la patogïnesis de enfermedades autoinmunes. [Zhou et al., Immunol. Res. 26:323-336, (2002) ]. Los receptores de TNF controlan mïltiples actividades inmunolïgicas de defensa asï como ciertos procesos de desarrollo a travïs de la activaciïn de NF-κB (Wallach et al., 1999) (Locksley et al., 2001) . La mayorïa de estos receptores son capaces de activar la vïa canïnica de NF-κB. Ademïs, el receptor de la linfotoxina-β (LTβR) , cuya expresiïn estï restringida a las cïlulas del estroma y varios receptores que se encuentran en los linfocitos (CD40, BLyS/BAFF y, tal y como se muestra en el presente trabajo - CD27) , tambiïn activan la vïa alternativa (Dejardin et al., 2002) (Coope et al., 2002) (Claudio et al., 2002) (Kayagaki et al., 2002) (Hatada et al., 2003) .

La seïalizaciïn para la activaciïn de NF-κB a travïs de varios receptores de la familia de receptores de TNF, se inicia por su uniïn a proteïnas adaptadoras de la familia TRAF. En cïlulas tratadas con TNF se ha mostrado que los TRAFs facilitan, en colaboraciïn con la proteïna adaptadora RIP, la incorporaciïn de los componentes del seïalosoma en el receptor de TNF p55 (Zhang et al., 2000) (Devin et al., 2000) (Devin et al., 2001) . Una proteïna adicional que participa en la activaciïn de NF-κB a travïs de la familia de receptores de TNF/NGF fue identificada como una “cinasa que induce NF-κB” (NIK) , (Malinin et al., 1997) .

Inicialmente se sugiriï que NIK mediaba en la activaciïn de la vïa canïnica de NF-κB como respuesta a mïltiples inductores con muchas funciones fisiolïgicas diferentes (Malinin et al., 1997) . Sin embargo, estudios posteriores de ratones de la cepa aly, que expresan un mutante de NIK no funcional, asï como de ratones con el gen NIK desactivado, impugnaron la nociïn de que NIK tuviera un papel funcional en las actividades de la mayorïa de estos inducto

res. Sugirieron mïs bien, que NIK participa selectivamente en la activaciïn de NF-κB a travïs de un conjunto restringido de ligandos que afectan de manera especïfica al desarrollo y la funciïn de los linfocitos (Shinkura et al., 1999) (Yin et al., 2001) . Ademïs, basïndose en la caracterizaciïn de cïlulas obtenidas a partir de estos ratones mutantes, se sugiriï que NIK no participa en absoluto en la vïa canïnica de NF-κB, sino que sirve exclusivamente para activar la vïa alternativa (Pomerantz y Baltimore, 2002) . Los linfocitos de ratones mutantes para NIK muestran un patrïn de diferenciaciïn altamente aberrante (Miyawaki et al., 1994) (Shinkura et al., 1999) (Matsumoto et al., 1999) (Yamada et al., 2000) (Karrer et al., 2000) (Fagarasan et al., 2000) , por lo tanto, el presente trabajo pretende evaluar de nuevo la funciïn seïalizadora de NIK en los linfocitos.

En la actualidad, la funciïn de NIK en los linfocitos se ha vuelto a evaluar determinando el efecto de su agotamiento o inhibiciïn in vitro en cïlulas cultivadas de lïneas linfoblastoides. Los ensayos que mostraban que NIK no se requiere para la activaciïn de la vïa canïnica a travïs de TNF en los linfocitos, se confirmaron. Sin embargo, tal y como se detalla a continuaciïn, se observï que NIK desempeïaba un papel crucial en estas cïlulas en la activaciïn de la vïa alternativa, asï como de la vïa canïnica a travïs de un ligando de CD40 (CD40L) y la inducciïn de BLyS/BAFF. Ademïs, se observï que CD27 (Camerini et al., 1991) , un receptor de la familia de TNF/NGF que se expresa principalmente en los linfocitos T y los linfocitos B de memoria y que se habïa sugerido anteriormente que activaba NF-κB (Yamamoto et al., 1998) en una forma independiente de NIK (Akiba et al., 1998) , iniciaba la vïa alternativa. Los inventores tambiïn descubrieron que NIK se une a SIVA, una proteïna asociada con CD27 (Prasad et al., 1997) , y media en la vïa canïnica y la vïa alternativa de activaciïn de NF-κB, como respuesta a este receptor. Aunque NIK no era necesario para la activaciïn del seïalosoma a travïs del receptor de TNF p55, la activaciïn del seïalosoma a travïs de CD27 dependïa de NIK. Por otra parte, a diferencia de la activaciïn a travïs del receptor de TNF p55, la activaciïn a travïs de CD27 inducïa, en una manera dependiente de NIK, la incorporaciïn selectiva de IKK1 a este receptor, un proceso que podrïa ser el evento inicial en la activaciïn dependiente de NIK de las dos vïas de NF-κB por medio de CD27.

La funciïn biolïgica... [Seguir leyendo]

1. Uso de un agente en la preparaciïn de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inmune causado o agravado por una activaciïn anormal de NF-κB a travïs de la vïa canïnica, en donde dicho agente es un anticuerpo capaz de unirse a las coordinadas de aminoïcido.

12. 175 de SIVA1 (SEQ ID NO: 3) o a las coordenadas de aminoïcido.

5. 110 de SIVA2 (SEQ ID NO: 4) , una molïcula de ARN pequeïo de interferencia o una ribozima en donde el ARN pequeïo de interferencia o la ribozima regula a la baja el gen diana SIVA.

2. Un agente para uso en el tratamiento de un trastorno inmune causado o agravado por una activaciïn anormal de NF-κB a travïs de la vïa canïnica, en donde dicho agente es un anticuerpo capaz de unirse a las coordinadas de aminoïcido.

12. 175 de SIVA1 (SEQ ID NO: 3) o a las coordenadas de aminoïcido.

5. 110 de SIVA2 (SEQ

ID NO: 4) , una molïcula de ARN pequeïo de interferencia o una ribozima en donde el ARN pequeïo de interferencia o la ribozima regula a la baja el gen diana SIVA.

3. El uso segïn la reivindicaciïn 1 o el agente para uso segïn la reivindicaciïn 2, en donde dicho trastorno inmune se selecciona entre el grupo que consiste en mieloma mïltiple (MM) , sïndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) , sïndrome de Sjogren (SS) , leucemia linfocïtica crïnica de linfocitos B (LLC-B) , lupus eritematoso sistï

mico, enfermedad de colon inflamatorio, sïndrome de respuesta inflamatoria sistïmica (SRIS) , sïndrome de disfunciïn multiorgïnica (SDMO) y sïndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) .

4. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse especïficamente a una regiïn de una secuencia de aminoïcidos indicada por las coordinada.

12. 175 de SEQ ID NO: 3.

5. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse especïficamente a una regiïn de una secuen20 cia de aminoïcidos indicada por las coordinada.

5. 110 de SEQ ID NO: 4.

6. Un mïtodo in vitro para identificar un modulador inmune putativo, comprendiendo el mïtodo identificar una molïcula capaz de incrementar o disminuir la formaciïn del complejo NIK-SIVA, siendo dicha molïcula el modulador inmune putativo.

7. Un mïtodo in vitro para escrutar molïculas capaces de disminuir la actividad de NIK que comprende poner

en contacto una cïlula con un ligando de un miembro de la familia de receptores de TNF/NGF seleccionado entre CD70, CD40L y Blys/BAFF capaz de inducir la vïa canïnica y alternativa de NF-κB dependiente de NIK, incubar la cïlula antes, durante o despuïs de dicha puesta en contacto con molïculas sometidas a ensayo individuales, detectar la activaciïn de la vïa canïnica de NF-κB en la cïlula y seleccionar la/s molïculas individuales capaces de disminuir la inducciïn de la vïa canïnica de NF-κB inducida por dicho ligando.

8. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 7, en donde las cïlulas son de tipo linfoblastoide.

9. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 7, en donde la/s molïculas seleccionadas son capaces de disminuir la inducciïn de la vïa canïnica inducida a travïs de dicho ligando pero no a travïs de cualquier otro ligando capaz de inducir la vïa canïnica de NF-κB de una manera independiente de NIK.

10. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 8 o 9, en donde la cïlula se selecciona a partir de cïlulas Ramos, Raji y 35 BJAB.

11. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 9, en donde el ligando capaz de inducir la vïa canïnica de NF-κB de una manera independiente de NIK es TNF.

12. El mïtodo segïn una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la activaciïn de la vïa canïnica

de NF-κB se detecta controlando parïmetros seleccionados entre la degradaciïn de IκB, la fosforilaciïn de IκBα y la 40 translocaciïn de p65.