METODO DE VALORACIÓN DE VIRULENCIA DE CEPAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX Y USO DE LOS AGREGADOS BACILARES DE CEPAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX EN CULTIVO LÍQUIDO PARA DICHA VALORACIÓN.

Método de valoración de virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex y uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para dicha valoración.

Tras constatar que la mayor capacidad virulenta de cepas de Mycobacterium tuberculosis se relacionaba con el tamaño de las agrupaciones bacilares contenidas en el cultivo bacilar, el método propone valorar dicha virulencia a partir de la determinación de la distribución de tamaños de los agregados bacilares de cada cepa analizada a partir de muestras obtenidas tras su crecimiento en un medio líquido hasta la fase tardía del crecimiento logarítmico.

Método de valoración de virulencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex

y uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en

cultivo líquido para dicha valoración

5 Campo de la técnica

La presente invención concierne a un método apto para valorar la virulencia de

cepas de Mycobacterium tuberculosis complex, a partir del análisis de las

distribuciones de tamaño (equivalente a considerar las áreas que ocupan) de las

1 O agregaciones bacilares presentes en un cultivo in vitro de dichas cepas en medio

líquido.

La invención propone también usar la distribución de tamaños de los agregados

bacilares de una cierta cepa de Mycobacterium tuberculosis complex, en cultivo líquido

para, tras su determinación proceder a la valoración de su virulencia.

15 La tuberculosis es una enfermedad ocasionada a partir de la infección por vía

aérea (generalmente) de los macrófagos alveolares, por el bacilo Mycobacterium

tuberculosis. En la mayoría de los casos, la inoculación del bacilo se convierte en una

infección latente que puede permanecer durante años controlada gracias a la

respuesta inmune del hospedador. Sin embargo, en un porcentaje de un 5%, la

20 infección puede evolucionar hacia enfermedad años después de la inoculación. Este

tipo de forma de tuberculosis, llamada post-primaria, se genera usualmente en los

lóbulos pulmonares superiores. Esta zona, al tener una concentración de oxígeno más

alta que en el resto del pulmón como consecuencia de una menor irrigación capilar, y

debido a ello, también hay una menor vigilancia inmunológica contra posible

25 microorganismos patógenos, favorece el crecimiento más rápido del bacilo antes que la

respuesta inmune tenga lugar. Cuando ésta se desarrolla, tiene una intensidad mayor a

la habitual, debido a la mayor carga bacilar que soporta el tejido.

Como consecuencia se genera un proceso necrótico que no puede ser

estructurado, como sucede habitualmente, mediante tejido colágeno, con lo que se

30 genera una licuefacción del tejido y consecuentemente se favorece el crecimiento

extracelular del bacilo. De esta manera se perpetua el fenómeno de infección y

destrucción de macrófagos y con ello de la destrucción de tejido que lleva a la

producción de una gran lesión que llega a erosionar a los bronquios; como resultado se

produce el drenaje del tejido licuefactado y la constitución de aerosoles infectados

35 para poder infectar nuevos sujetos, dando lugar a lesión típica de la enfermedad

tubeculosa: la lesión cavitada.

Así pues, se puede definir el concepto/parámetro virulencia en las cepas de Mycobacterium tuberculosis como aquella habilidad para crecer rápidamente en el pulmón cuando las condiciones son las adecuadas, para de esta manera generar una respuesta inflamatoria desmesurada y con ello la formación de licuefacción, que es el verdadero punto de partida de una destrucción del tejido importante y con ello la generación de la enfermedad.

Antecedentes de la invención Habitualmente el parámetro de virulencia de una cepa de Mycobacterium tuberculosis complex se ha determinado mediante la caracterización de la velocidad de crecimiento en cultivos in vitro en medios acelulares; o midiendo este parámetro en cultivos de macrófagos ex vivo. También se han utilizado modelos in vivo observando la capacidad de generar lesiones, ya sea en cuanto a número (en cobayas) o en extensión (en ratones) .

La CA 2732750 describe un método para detectar una infección con Mycobacterium tuberculosis que comprende detectar la presencia de células CD8+ T en una muestra biológica.

Breve explicación de la invención Tras la optimización de un modelo de virulencia basado en la cuantificación de la velocidad de crecimiento en pulmón de ratones durante las dos primeras semanas de la infección tras la inoculación endovenosa de 1 04 CFUs, se observó que, sorprendentemente, la mayor capacidad virulenta de una cepa se relacionaba con la distribución de tamaños de las agrupaciones bacilares contenidas en su cultivo en medio líquido en la fase tardía del crecimiento logarítmico.

La invención propone, en consecuencia, la determinación y el análisis de la distribución de tamaños y formas de las agrupaciones bacilares de una cierta cepa para la determinación de su potencial virulencia. El proceso a seguir para esta determinación comprende cuatro etapas básicas:

a) preparación de un cultivo líquido de la cepa de Mycobacterium

tuberculosis complex a estudiar, según el proceso estándar detallado más adelante;

e) determinación de la distribución de tamaños o áreas, y formas de las agrupaciones bacilares de la cepa mediante técnicas de análisis de imagen, técnicas citométricas u otras técnicas de determinación de tamaños que se consideren apropiadas, y

d) valoración de la virulencia de la cepa en función de la distribución obtenida, conforme al siguiente criterio:

• en las cepas rápidas, o más virulentas, en las que se han observado más agregados grandes y menos bacilos libres la distribución es de tipo log-normal, con una frecuencia más alta de agregados de medida intermedia, y

• en las cepas lentas, o menos virulentas, en las que se observan más bacilos libres, la forma de la distribución es una exponencial decreciente.

Para ello, se propone un método de obtención de muestras y análisis de imagen que permite determinar las distribuciones mencionadas (pasos 2 y 3 del proceso descrito) , aunque la invención no se limita a este método, sino que abre la posibilidad de desarrollar otros métodos más eficaces para dicha determinación. Las etapas básicas de dicho método son:

i. disposición de las muestras obtenidas (10 o más) sobre un portaobjetos de vidrio y utilización de un fijador de los bacilos y teñido de la muestra para identificación de los bacilos de Mycobacterium tuberculosis;

ii. obtención de una serie de fotografías con aumento (1 00 o más aumentos) , de cada portaobjetos, a través de microscopía óptica; y

iii. tratamiento de las imágenes para permitir identificar los agregados bacilares El tratamiento de las imágenes de la etapa iii) comprende, en una realización preferida, los pasos siguientes: 1) conversión de las partes representativas de las regiones bacilares en un color diferenciado del color del medio que las rodea;

2) cálculo mediante la ayuda de un programa informático del área total ocupada por cada agrupación bacilar y su excentricidad, obteniendo el área media de los agregados y el porcentaje de agregados pequeños (bacilos libres) ; y

serie que proporcionan intervalos de valores. cuantas áreas existen en diferentes

5 1 O 15 Breve descripción de las figuras La Fig. 1a es un histograma que refleja la proporción en% de los agregados o agrupaciones bacilares en el caso de unas cepas más virulentas y la Fig. 1 b corresponde a una fotografía de 100 aumentos obtenida por microscopia óptica de dichos agregados, en donde los bacilos, debido a una tinción, están en un color distinto del color del medio. La Fig. 2a es un histograma equivalente pero correspondiente a unas agrupaciones bacilares menos virulentas, apreciando la distinta configuración del histograma. La Fig. 2b es una fotografía de 100 aumentos de los correspondientes agregados. Por último la Fig. 3 muestra, mediante unos diagramas estadísticos de oblicuidad (skewness}, la asimetría de una y otra distribución de bacilos.

Descripción en detalle de la invención

20 25 30 En esta invención de propone el uso del análisis de la distribución de tamaños de las agrupaciones bacilares en un cultivo en medio líquido para determinar la potencial virulencia de una cepa. A continuación se describen con detalle los cuatro pasos del método desarrollado hasta el momento para la determinación de la dicha distribución. Como se ha mencionado anteriormente, los pasos 2 y 3 pueden variar en función de la técnica escogida para la determinación de las distribuciones de tamaños. Se exponen los pasos a seguir utilizando para la determinación de las distribuciones técnicas de análisis de imagen. En primer lugar se presenta el método experimental utilizado, que comprende las etapas de cultivo...

1. Método de valoración de la virulencia de cepas de Mycobacterium

tuberculosis complex, que se caracteriza por las siguientes etapas: a) preparación de un cultivo in vitro en medio líquido de la cepa a analizar; b) obtención de varias muestras del cultivo en la fase tardía de su crecimiento logarítmico;

e) determinación de la distribución de tamaños o áreas, y formas de los agregados bacilares de las muestras y obtención de una distribución promedio de cada cepa; y

d) valoración a partir de la forma de dicha distribución de tamaños la virulencia, conforme al siguiente criterio:

• en las cepas rápidas, o más virulentas, en las que se han observado más agregados grandes y menos bacilos libres, la distribución es de tipo log-normal, con una frecuencia más alta de agregados de medida intermedia, y

• en las cepas lentas, o menos virulentas, en las que se observan más bacilos libres, la forma de la distribución es una exponencial decreciente.

2. Método de valoración, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha determinación de las distribuciones de tamaños y forma de los agregados bacilares de las cepas de Mycobacterium tuberculosis a estudiar, cultivadas in vitro en medio líquido, se realiza mediante técnicas de análisis de imagen comprendiendo en relación con las etapas a) a e) citadas las siguientes operaciones:

i. preparación de varias muestras de cada una de las cepas a valorar, tras su crecimiento en un medio líquido hasta la fase tardía del crecimiento logarítmico, disponiéndolas sobre un portaobjetos de vidrio y utilización de un fijador de los bacilos y teñido de la muestra para identificación de los bacilos de Mycobacterium tuberculosis;

ii. obtención de una serie de fotografías con aumento, de cada portaobjetos, a través de microscopía óptica;

iii. tratamiento de las imágenes para permitir identificar los agregados bacilares mediante la conversión de las regiones bacilares en un color diferenciado del color del medio que las rodea;

y porque dicha valoración comprende las siguientes etapas:

iv. cálculo, mediante la ayuda de un programa informático, del área total

ocupada por los bacilos en las imágenes, obteniendo el área media de los

agregados y el porcentaje de agregados pequeños (bacilos libres) ; y

v. obtención de una distribución de tamaños de los agregados bacilares de

cada cepa analizada realizando la media de las distribuciones

correspondientes a las diferentes fotografías de cada serie que

proporcionan cuantas áreas existen en diferentes intervalos de valores.

3. Método de valoración según la reivindicación 2, caracterizado porque el número mínimo de muestras por cepa es de 10.

4. Método de valoración según la reivindicación 2, caracterizado porque se utiliza metanol como fijador de los bacilos y el teñido se realiza con el método de Ziehi-Neelsen.

5. Método de valoración según la reivindicación 2, caracterizado porque el número de aumentos de las fotografías de microscopia óptica es de al menos 1 OO.

6. Método de valoración según la reivindicación 2, caracterizado porque el tratamiento de las fotografías para identificación de los agregados bacilares consiste en convertir su contenido a escala de grises, de manera que las regiones bacilares quedan oscuras y el medio resta claro, y para posteriormente ser convertido a blanco (medio) y negro (bacilos y agregados) en función de su tono de gris.

7. Método de valoración según la reivindicación 2, caracterizado porque el tratamiento de las fotografías expresado para identificación de los agregados bacilares comprende una identificación de los agregados bacilares mediante código RGB, asignando un rango del vector RGB como negro (bacilos y agregados) y fuera del citado rango realizar una conversión a blanco (medio) .

8. Método de valoración según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa e) se calcula, además del área indicada, la excentricidad, es decir el grado de alargamiento de cada agregado, que se toma en consideración para la etapa d) .

.

10. Método de valoración según la reivindicación 1 ó 2 caracterizada porque se toma en consideración también la proporción de bacilos libres respecto al número de agregados, proporcionando una variable correlacionada con la virulencia y que informa de una cepa poco virulenta si dicha proporción de bacilos libres es alta y califica la cepa de alta virulencia si la indicada proporción es baja.

1.

11. Uso de los agregados bacilares de cepas de Mycobacterium tuberculosis complex en cultivo líquido para la valoración de la virulencia de las cepas, caracterizado porque comprende determinar la distribución de tamaños ó áreas, y formas de los agregados bacilares de una cepa de Mycobacterium tuberculosis