MÉTODO Y SISTEMA PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Un método para la amplificación directa de ADN usando un ARNm diana como molde,

que comprende: (A) mezclar una solución de tampón que tiene un pH ácido, un tensioactivo y un tejido que se ha recogido de un cuerpo vivo que comprende un componente de ARN, en el que el pH ácido está en el intervalo de pH 2,5 a pH 5, (B) homogeneizar la mezcla resultante de la etapa (A), (C) preparar una solución de reacción que comprende la mezcla homogeneizada resultante de la etapa (B), un cebador y una ADN polimerasa, sin separar el componente de ARN de una fase líquida de la mezcla homogeneizada resultante de la etapa (B), y (D) amplificar el ADN usando un ARNm diana como molde dentro del componente de ARN en la solución de reacción resultante de la etapa (C)

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2003/000060.

Solicitante: SYSMEX CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-5-1, WAKINOHAMA-KAIGANDORI, CHUO-KU KOBE-SHI, HYOGO 651-0073 JAPON.

Inventor/es: YOSHIDA, TOMOKAZU, NAKABAYASHI,KAZUKI, TADA,SACHIYO, SHOHMI,KEIICHIRO, YAMAGATA,KOICHI, NISHIDA,MASAHIRO.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 8 de Enero de 2003.

Clasificación PCT:

  • C12N15/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N9/99 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Inactivación de enzimas por tratamiento químico.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/566 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

Clasificación antigua:

  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N9/99 C12N 9/00 […] › Inactivación de enzimas por tratamiento químico.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.


Fragmento de la descripción:

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un método para tratar muestras biológicas que contienen ácidos nucleicos y, más específicamente, al método que permite detectar de forma sencilla y rápida genes de interés mediante una amplificación 5 de ácido nucleico, sin extraer directamente los componentes de ácido nucleico de la muestra biológica, en un campo en el que se realiza el diagnóstico de tumores y cánceres, la detección de la infección con virus y bacterias, así como diversas enfermedades genéticas usando medios para la amplificación de ácido nucleico.

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Antecedentes de la Invención

Avances recientes en la tecnología de genes y la biología molecular han hecho posibles diagnósticos de enfermedades 10 tales como enfermedades infecciosas y enfermedades genéticas a niveles de ADN y ARN. El análisis de genes se ha facilitado enormemente por el método para la amplificación de ácido nucleico, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Science, 230: 1350-1354, 1985), NASBA (Amplificaciones Basadas en la Secuencia de Ácido Nucleico, Nature, 350, 91-92, 1991; Patente Japonesa Nº 2648802; Patente Japonesa Nº 2650159) y LAMP (amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle, Publicación de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 15 2001-242169), en particular, por el que se ha hecho posible la detección de una cantidad traza de ácidos nucleicos en muestras biológicas, que ha sido extremadamente difícil de detectar.

La PCR es un método que permite amplificar un fragmento de ADN objetivo cientos de miles de veces por repetición de un ciclo de disociación de dobles cadenas de ADN en cadenas sencillas, unión de cebadores a secuencias que flanquean una región específica de cadenas de ADN y síntesis de ADN mediante una ADN polimerasa. El método se 20 inventó por Mullis y otros, y se describe en la Publicación de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº S61-274697. Puede usarse PCR como un método sensible para analizar ácidos nucleicos de diversas muestras y particularmente útil para analizar ácidos nucleicos en muestras obtenidas de fluidos corporales de animales. Por consiguiente, se utiliza PCR para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas y cánceres. Además, el método es adecuado para el tipado de ADN tras un trasplante y la identificación de una relación de padre-25 hijo. En estos casos, con frecuencia se usa sangre periférica como muestra a examinar.

Uno de los inconvenientes de la PCR es que la reacción se ve interferida por pigmentos, proteínas, azúcares y otros contaminantes desconocidos. De hecho, es ampliamente conocido que además de la ADN polimerasa termorresistente usada más frecuentemente, una ADN polimerasa Taq derivada de Thermas aquaticus, varias ADN polimerasas se inhiben claramente por la presencia de trazas de contaminantes derivados de fluidos corporales. 30

La RT-PCR es un método en el que el ARN extraído de, por ejemplo, tejidos tumorales, se convierte en ADNc mediante una transcriptasa inversa (RT) usando un oligo (dT) o un hexámero aleatorio como cebador, parte de los ADNc se utilizan para una amplificación de PCR, y después se usan para la detección. Un caso que usa este método para diagnosticar un fibroblastoma se describe en (Hokkaido Igaku Zasshi, págs. 135-141, Vol. 66 (2), 1991). Puesto que la RT-PCR depende de ARNm que tiende a degradarse, es necesario un tratamiento rápido después de la recogida de 35 una muestra. Además, debe tenerse especial cuidado para evitar que la muestra se contamine con otras, ya que la RT-PCR es un método extremadamente sensible para la detección de ADN.

LAMP es un método para la amplificación génica usando más de dos conjuntos de cebadores que comprenden cebadores especiales que forman estructuras de horquilla en extremos distales de productos de amplificación a medida que se desarrolla la reacción de desplazamiento de cadena. Los productos de amplificación consistían en muchas 40 estructuras repetidas, cuya unidad de estructura de repetición consiste en una región complementaria en las mismas cadenas en la que se invierten las secuencias de bases de un ácido nucleico bicatenario. Aunque los productos de amplificación de LAMP pueden detectarse por un método públicamente conocido para la detección de ADN bicatenario, se describe un método de detección que se aprovecha de su estructura única (Publicación de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 2001-242169, WO 00/28082). 45

Otras líneas del método para la amplificación génica, TMA, NASBA y 3SR, se caracterizan por el uso de cebadores que llevan la secuencia promotora de T7 en uno de las dos cadenas de cebadores. Por lo tanto, cuando estos cebadores hibridan con un ADN o ARN diana seguido de una transcripción inversa (una síntesis de ADN usando ARN o ADN como molde), se sintetiza un ADN bicatenario con un promotor de T7. Se sintetiza una gran cantidad de ARN como producto amplificado por adición de una polimerasa de T7 a este sistema de reacción, como resultado de la activación del 50 promotor de T7, seguida de la expresión de genes cadena abajo. En la TMA, NASBA y 3SR, los ciclos de amplificación descritos anteriormente se desarrollan a una temperatura constante.

Un sistema para la detección de ácido nucleico que utiliza medios para la amplificación de ácido nucleico está compuesto generalmente por un proceso para el tratamiento de materiales biológicos, un proceso de extracción de ácidos nucleicos, un proceso para dispensar reactivos de medición, un proceso para la amplificación de ácido nucleico y 55 un proceso para la evaluación de los productos de amplificación. Es necesario un proceso de tratamiento preliminar para la extracción de ácidos nucleicos antes de la amplificación de ácido nucleico por métodos tales como un método de PCR. Se han usado métodos para la extracción de ácidos nucleicos en los que los materiales que contienen genes se

degradan por una enzima, un tensioactivo o un agente caotrópico, y después se lleva a cabo de un tratamiento mediante fenol (Biochemica et Biophysica Acta, 72: 619-629, 1963), condiciones alcalinas (Nucleic Acid Research, 7: 1513-1523, 1979) o fenol-cloroformo y etc. Últimamente se usan resinas de intercambio iónico, un filtro de vidrio, perlas de vidrio o un reactivo que tiene una actividad agregante para proteínas en el proceso de extracción de ácidos nucleicos. 5

Como sistema que utiliza un vehículo de unión a ácido nucleico para la extracción de ácidos nucleicos, se describe un método de uso de partículas de vidrio y yoduro sódico (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76-2: 615-619, 1979) y un método de uso de hidroxiapatita (Publicación de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº S63-263093) y etc. En estos métodos, mientras que se limita el uso de reactivos tóxicos tales como un disolvente orgánico, en su lugar existe un problema en el sentido de que lleva mucho tiempo aislar ácidos nucleicos debido a la centrifugación repetida durante el 10 proceso, haciendo difícil manejar muchas muestras al mismo tiempo.

Como se describe, los métodos convencionales para el aislamiento de ácidos nucleicos tienen desventajas en el sentido de que emplean reactivos peligrosos tales como el disolvente orgánico y sustancias alcalinas, requieren etapas de centrifugación, haciendo difícil manipular muchas muestras al mismo tiempo. La desventaja se hace incluso más grave en vista de la automatización, en el que se tratan muchas muestras con gran reproducibilidad para reducir los costes de 15 personal.

Como método para automatizar el proceso para la extracción de ácidos nucleicos, existe un método de uso de partículas de silicato de unión a ácido nucleico e iones caotrópicos (J. Clinical Microbiology, 28-3: pág. 495-503, 1990, Publicación de Patente...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para la amplificación directa de ADN usando un ARNm diana como molde, que comprende:

(A) mezclar una solución de tampón que tiene un pH ácido, un tensioactivo y un tejido que se ha recogido de un cuerpo vivo que comprende un componente de ARN, en el que el pH ácido está en el intervalo de pH 2,5 a pH 5, 5

(B) homogeneizar la mezcla resultante de la etapa (A),

(C) preparar una solución de reacción que comprende la mezcla homogeneizada resultante de la etapa (B), un cebador y una ADN polimerasa, sin separar el componente de ARN de una fase líquida de la mezcla homogeneizada resultante de la etapa (B), y

(D) amplificar el ADN usando un ARNm diana como molde dentro del componente de ARN en la solución de reacción 10 resultante de la etapa (C).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la solución de reacción de la etapa (C) comprende además un inhibidor de nucleasas.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la de la etapa (A) comprende además mezclar una sal, que interacciona con un inhibidor de la reacción de amplificación de ácido nucleico, con dicha solución de tampón y dicho 15 tejido recogido de un cuerpo vivo.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en que el inhibidor de nucleasas es un inhibidor de ARNasa.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en que el la sal es una sal caotrópica.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en que el la sal es una sal de metal alcalino del ácido trihaloacético.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido es un ganglio linfático. 20

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ARNm diana se selecciona del grupo que consiste en un marcador de cáncer y un marcador asociado a tumor.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el marcador asociado a tumor se selecciona del grupo que consiste en ARNm de citoqueratina 18, ARNm de citoqueratina 19, ARNm de citoqueratina 20 y ARNm de CEA.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (D) se lleva a cabo por un método seleccionado del 25 grupo que consiste en RT-LAMP y RT-PCR.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además: (E) detectar el producto de amplificación resultante de la etapa (D).

12. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la sal es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en NaCl, KCl, NaI, KI, TMACl (cloruro de tetrametil amonio), TEACl (cloruro de tetraetil amonio), KSCN, CsSCN 30 y CsCl.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la sal es CF3COOCs (trifluoroacetato de cesio).

14. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la mezcla homogeneizada resultante se trata además con un material sólido aniónico antes de amplificar dicho ADN.

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