Un método de determinación de si una muestra de test contiene un ácido nucleico objetivo,

comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra de test con un agente de amplificación para una reacción de amplificación; (b) amplificar al menos una porción del ácido nucleico objetivo en la muestra; (c) medir las señales obtenidas en diversos puntos en la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de ácido nucleico objetivo presente; (d) determinar una transformada relacionada con la eficacia de la reacción de amplificación, donde la transformada relacionada con la eficacia de la reacción de amplificación es la primera derivada de las señales obtenidas de la amplificación; (e) determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformada relacionada con la eficacia; y (f) determinar que la muestra de test contiene un ácido nucleico objetivo si el valor relacionado con la eficacia para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, realizándose dicha determinación si el valor relacionado con la eficacia excede un valor seleccionado comparando el valor relacionado con la eficacia con una curva de criterios, donde la curva de criterios se determina: - realizando una pluralidad de reacciones de amplificación sobre muestras negativas, siendo dichas muestras negativas muestras que carecen del ácido nucleico objetivo; - determinando el valor relacionado con la eficacia para cada muestra negativa; - determinando la media y la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas; y - determinando que cualquier muestra que tiene cualquier valor relacionado con la eficacia que excede la media por un múltiplo seleccionado de la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas contiene el ácido nucleico objetivo

AVISO SOBRE DERECHOS DE AUTOR

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al análisis de datos de reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere a un sistema de información y un método para realizar determinaciones relativas a reacciones químicas y/o biológicas. La invención también involucra un método alternativo de cuantificación de ácidos nucleicos en una muestra que comprende amplificación de un ácido nucleico objetivo y el análisis de los datos obtenidos durante la reacción de amplificación. La invención involucra además un sistema de diagnóstico y/o un kit que usa la amplificación de ácido nucleico en tiempo real, incluyendo el análisis de PCR pero sin limitarse a éste.

2. DISCUSIÓN DE LA TÉCNICA

En muchos diferentes campos industrial, médico, biológico y/o de investigación, es deseable determinar la cantidad de un ácido nucleico de interés. Algunos métodos de cuantificación de los ácidos nucleicos de interés involucran la amplificación de los mismos y la observación de una señal proporcional a la cantidad de productos amplificados producidos; otros métodos involucran la generación de una señal en respuesta a la presencia de un ácido nucleico objetivo, cuya señal se acumula sobre la duración de la reacción de amplificación. Como se usa en este documento, la reacción de amplificación del ácido nucleico se refiere tanto a la amplificación de una porción de la secuencia de un ácido nucleico objetivo como a la amplificación y acumulación de la señal indicativa de la presencia de ácido nucleico objetivo, prefiriéndose frecuentemente la primera a la última. La cuantificación de los ácidos nucleicos se hace más difícil o menos precisa, o ambas cosas, debido a que los datos capturados durante las reacciones de amplificación frecuentemente se obscurecen significativamente por señales que no se generan en respuesta al ácido nucleico objetivo (es decir, el ruido). Además, los datos capturados por muchos métodos de supervisión pueden estar sujetos a variaciones y falta de reproductibilidad debidas a condiciones que pueden cambiar durante una reacción o cambiar entre los diferentes instantes de una reacción. A la vista de lo anterior, existe una necesidad de desarrollar medios mejorados de cuantificación de ácido nucleico. Cuando se activa la cuantificación de los ácidos nucleicos por reacciones de amplificación, también existe una necesidad de mejorar los métodos actuales de detección de reacciones de amplificación sospechosas o inválidas. Queda además una necesidad de mejorar las capacidades actuales para distinguir entre las reacciones de amplificación que no detectan un ácido nucleico objetivo (es decir, reacciones negativas) a partir de señales débiles obtenidas de reacciones de amplificación que sufren de bajas cantidades de un ácido nucleico en una muestra, o un grado de inhibición de la reacción de amplificación, u otras causas. La presente invención proporciona mejoras en estas áreas como se trata más adelante.

A continuación sigue una lista no exhaustiva de referencias que proporcionan información de antecedentes con respecto a la presente invención:

Análisis de Datos de Relativos a la Expresión de Genes Usando PCR Cuantitativa en Tiempo Real y el Método 22DDCT, en METHODS 25: 402-208 (2001) doc: 10.1006/método 2001. 1262 de Livak, k y Schmittgen, T.

Cuantificación absoluta de mRNA usando ensayos de PCR de transcripción inversa en tiempo real, Diario de Endocrinología Molecular 25: 169-193 (2000) de Bustin SA.

Cuantificación de mRNA usando una PCR de transcripción inversa en tiempo real: tendencias y problemas, Diario de Endocrinología Molecular 29: 23-29 (2002) de Bustin SA.

Aunque los inventores no pueden garantizar que la siguiente página Web permanecerá disponible y no necesariamente avalen cualesquiera opiniones expresadas en la misma, una persona interesada puede desear referirse a la página Web www.wzw.turn.de/gene-quantification/index.shtml para información útil de antecedentes.

La discusión de cualesquiera obras, publicaciones, ventas o actividad en cualquier parte en esta presentación, incluyendo cualesquiera documentos presentados con esta solicitud, no pretende ser un reconocimiento en ningún modo de cualquiera de tales trabajos que constituye la técnica anterior, a menos que se especifique lo contrario. De forma similar, la discusión de cualquier actividad, trabajo o publicación en este documento no es un reconocimiento de que tal actividad, trabajo o publicación se conozca en cualquier jurisdicción particular.

La PCR en tiempo real es una reacción de amplificación usada para la cuantificación de ácidos nucleicos objetivos en una muestra de test.

Convencionalmente, los técnicos especialistas típicamente ven la reacción de amplificación comprendida en tres fases distintas. En primer lugar hay una fase de fondo o de línea base, en la cual el ácido nucleico objetivo se está amplificando pero la señal proporcional a la cantidad de ácido nucleico objetivo no puede detectarse porque es demasiado pequeña para ser observada con relación a señales independientes del objetivo (a veces llamado "fondo" o "señal de fondo"). A continuación, hay una fase logarítmica en la cual la señal crece sustancialmente de modo logarítmico porque la señal es sustancialmente proporcional a la cantidad de ácido nucleico objetivo en la reacción de amplificación y es mayor que la señal de fondo. Finalmente, el crecimiento en la señal se ralentiza durante una fase "plana" reflejando una fase de amplificación menor que la amplificación logarítmica del ácido nucleico objetivo. Como es sabido en la técnica, el tiempo en el cual la fase logarítmica cruza un valor umbral, que es un valor algo mayor que el valor de la señal de fondo, está relacionada de forma reproducible con el logaritmo de la concentración del ácido nucleico objetivo. Este método de la técnica anterior se denomina de forma genérica como el método Ct, quizás llamado de esta forma por el Ciclo en el cual la señal cruza el umbral. El análisis de Ct es razonablemente reproducible y preciso, pero sufre de algunos inconvenientes, que no necesitan tratarse en este punto para entender la presente invención.

La Patente de los Estados Unidos Nº 6.303.305 desvela un método de cuantificación de ácidos nucleicos que emplea reacciones PCR. El método desvelado emplea la derivada enésima de la curva de crecimiento de una reacción de amplificación de ácido nucleico fluorescente. El método evita de forma eficaz la necesidad de realizar una corrección de la línea base, pero no proporciona ningún método fiable de determinación entre muestras reactivas y muestras no reactivas, y no sugiere razonablemente cómo usar el cálculo de la derivada enésima para evaluar la validez de los resultados obtenidos. Además, las señales de amplificación del ácido nucleico resultantes de cualesquiera artefactos en el sistema (por ejemplo, el acoplamiento o el solapamiento positivo – definido como infra) no pueden distinguirse de las respuestas positivas verdaderas usando los métodos desvelados en la misma y pueden conducir a falsos resultados positivos. Sin embargo, el cálculo de la primera derivada descrita por la Patente de los Estados Unidos Nº 6.303.305 proporciona un valor relacionado con la eficacia que es útil en el contexto de la presente invención. Los técnicos especialistas... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinación de si una muestra de test contiene un ácido nucleico objetivo, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de test con un agente de amplificación para una reacción de amplificación;

(b) amplificar al menos una porción del ácido nucleico objetivo en la muestra;

(c) medir las señales obtenidas en diversos puntos en la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de ácido nucleico objetivo presente;

(d) determinar una transformada relacionada con la eficacia de la reacción de amplificación, donde la transformada relacionada con la eficacia de la reacción de amplificación es la primera derivada de las señales obtenidas de la amplificación;

(e) determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformada relacionada con la eficacia; y

(f) determinar que la muestra de test contiene un ácido nucleico objetivo si el valor relacionado con la eficacia para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, realizándose dicha determinación si el valor relacionado con la eficacia excede un valor seleccionado comparando el valor relacionado con la eficacia con una curva de criterios, donde la curva de criterios se determina:

- realizando una pluralidad de reacciones de amplificación sobre muestras negativas, siendo dichas muestras negativas muestras que carecen del ácido nucleico objetivo;

- determinando el valor relacionado con la eficacia para cada muestra negativa;

- determinando la media y la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas; y

- determinando que cualquier muestra que tiene cualquier valor relacionado con la eficacia que excede la media por un múltiplo seleccionado de la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas contiene el ácido nucleico objetivo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la primera derivada de las señales obtenidas desde la reacción de amplificación es igual a la diferencia entre dos señales consecutivas obtenidas desde la reacción de amplificación dividida por la magnitud del intervalo entre las señales consecutivas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la primera derivada de las señales obtenidas desde la reacción de amplificación se calcula por manipulación matemática de una curva ajustada a las señales obtenidas desde la reacción de amplificación.

4. El método de la reivindicación 1, en el que cualquier muestra que tiene cualquier valor relacionado con la eficacia que excede la media desde uno a aproximadamente 20 veces la desviación estándar de la transformada relacionada con la eficacia de las muestras negativas se considera que contiene ácido nucleico.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el valor seleccionado de la etapa (e) varía de acuerdo con el punto de reacción particular en el cual se produce el valor relacionado con la eficacia.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el valor seleccionado de la etapa (e) se determina (1) amplificando una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) seleccionando un valor que es más alto que todos los valores relacionados con la eficacia para muestras negativas.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el valor seleccionado de la etapa (e) se determina (1) amplificando una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) seleccionando un valor que separa los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas de los valores relacionados con la eficacia de las muestras positivas.