Un método in vitro para seleccionar un paciente altamente sensible a vacuna de WT1,

que comprende las siguientes etapas (a) y (b) :

(a) medir la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 en una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo y

(b) comparar el valor medido de (a) con el de un sujeto sano y evaluar la sensibilidad a vacuna de WT1 usando como un indicador que la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 de (a) es 1, 5 veces o más la de un sujeto sano.

Método para seleccionar pacientes adecuados para vacuna de WT1

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para seleccionar pacientes altamente sensibles a vacuna de WT1 y un método terapéutico para tratar cáncer que implica dicho método de selección. De forma más particular, la presente invención se refiere a un método para seleccionar pacientes altamente sensibles a vacuna de WT1 basándose en la frecuencia de precursores de CTL específicos de WT1 como un indicador y similares.

Antecedentes de la técnica

El gen WT1 (gen de tumor de Wilms 1) se ha identificado como uno de los genes causantes del tumor de Wilms que es un tumor renal de la infancia (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990) . El gen WT1 codifica el factor de transcripción WT1 y WT1 desempeña un papel importante en muchos procesos tales como proliferación, diferenciación y apoptosis de células y desarrollo de tejidos (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998) . El gen WT1 se definió originalmente como un gen supresor de tumores. Sin embargo, estudios posteriores revelaron que el gen WT1 está altamente expresado en leucemia y diversos cánceres sólidos incluyendo cáncer de pulmón y cáncer de mama y por lo tanto, se indica que el gen WT1 ejerce una función oncogénica que promueve el crecimiento canceroso. Además, se demostró que la estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica, siendo dichas células positivas para HLA-A*0201 o HLA-A*2402, con péptidos derivados de WT1 induce los linfocitos T citotóxicos específicos de péptido (CTL) y los CTL destruyen las células de leucemia o de tumor sólido que expresan de forma endógena WT1. Estos resultados demostraron que WT1 es una molécula diana prometedora para inmunoterapia de cáncer (Int. J. Hematol 76: 127, 2002) .

Ha habido métodos conocidos para determinar CTL específicos de péptido antigénico in vitro, incluyendo método de monómero de HLA, método de dímero de HLA y método de tetrámero de HLA (Science 274: 94, 1996) , método de pentámero de HLA y método de ELISPOT (J. Immunol. Methods 110:29, 1988) , técnica de RT-PCR en tiempo real (J. Immunol. Methods 210:195, 1997) , método de dilución limitante (Br. J. Cancer 77: 1907, 1998) y similares. El tetrámero de HLA se prepara por biotinilación de un complejo (monómero de HLA) formado por asociación de β2microglobulina y cadena α de HLA con un péptido y permitiendo que el monómero se una a avidina marcada con fluorescencia para tetramerización. Las frecuencias de CTL pueden medirse tiñendo CTL específicos de péptido con tetrámeros de HLA y analizando por citometría de flujo. La medición de frecuencias de CTL por método de monómero de HLA, método de dímero de HLA y método de pentámero de HLA puede llevarse a cabo basándose en el mismo principio.

Los CTL no estimulados con vacuna se denominan "células precursoras de CTL". Se considera que cuanto mayor sea la frecuencia de existencia de células precursoras de CTL específicas para un antígeno canceroso dado, más eficazmente pueden inducirse CTL específicos, cuando dicho antígeno se administra como una vacuna de cáncer, que hace más fácil conseguir respuesta química de terapia de vacuna de cáncer. En otras palabras, si un paciente que muestra alta frecuencia de existencia con respecto a células precursoras de CTL específicas para un antígeno de cáncer dado se selecciona antes de la vacunación, sería posible tratar más eficazmente mediante el uso de dicho antígeno de cáncer.

45 La frecuencia de células precursoras de CTL se midió usando tetrámero de HLA y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con melanoma y se ha presentado en varios artículos; sin embargo, muestran que la frecuencia de células precursoras de CTL específicas para péptido antigénico tumoral es baja (J. Immunother. 24: 66, 2001, Hum. Gene. Ther. 13: 569, 2002) . A partir de estos resultados, se ha considerado que la frecuencia de existencia de las células precursoras de CTL específicas para antígeno es generalmente baja y que es difícil seleccionar pacientes adecuados para una vacuna de cáncer basándose en la frecuencia de células precursoras de CTL como un indicador.

Tsuboi et al, 2002 (Cancer Immunol Immunother. 51, 614-620) describe un epítopo de unión a HLA-A2

55 inmunogénico de WT1 y la inducción de CTL específico después de exposición al mismo. Oka et al, 2002 (Curr Cane Drug Target, 2, 45-54) describe la generación de CTL específico de WT1 y rechazo de célula tumoral que expresa WT1 por vacunación de WT1. Los autores también describen un péptido derivado de WT1 inmunogénico, concretamente Db126.

Oka et al, 2000 (J Immunol, 164, 1873-1880) describe la inducción de CTL específico de WT1 en ratones después de administración de péptidos WT1 y posterior protección en estos ratones contra presentaciones tumorales. Los autores concluyen que están presentes precursores de CTL responsables de los péptidos de WT1.

Borrello et al, 2002 (Cancer Control, 9 (2) , 138-150) revisa varios candidatos potenciales para el desarrollo de 65 vacunas de cáncer, incluyendo WT1.

Maeda et al, 2002 (Brit J Cancer, 87, 796-804) describe un método para tratamiento de vacuna tumoral que implica la detección de células precursoras de CTL específicas de péptido en el estado de prevacunación. Los autores muestran que son detectables células precursoras de CTL específicas de péptido en la mayoría de los pacientes con cáncer, pero el porcentaje de estas células no implica automáticamente que la persona de ensayo padezca cáncer.

Descripción de la invención

En su sentido más amplio la presente invención se refiere a métodos como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

El fin de la presente invención es proporcionar un método para seleccionar un paciente altamente sensible a vacuna de WT1 basándose en la frecuencia de células precursoras de CTL específicas de WT1 como un indicador y similares.

El presente inventor preparó un tetrámero de HLA usando un péptido antigénico tumoral derivado de WT1 y usó el tetrámero resultante en la medición de frecuencia de células precursoras de CTL en pacientes de tumor maligno hematopoyético o cáncer de pulmón antes de la administración de la vacuna. Se descubrió sorprendentemente que las células precursoras de CTL (células precursoras de CTL específicas de WT1) existen en mayor frecuencia que las conocidas hasta ahora en comparación con individuos sanos. Este resultado reveló que es posible seleccionar pacientes altamente sensibles a vacuna de WT1 o identificar una molécula diana de vacuna de WT1 basándose en la frecuencia de células precursoras de CTL específicas de WT1 como un indicador, en lo que respecta al antígeno tumoral WT1. También, puesto que los pacientes que tienen diversos cánceres mostraron alta frecuencia de células precursoras de CTL específicas de WT1, resultó evidente que el diagnóstico del cáncer puede hacerse basándose en la frecuencia de células precursoras de CTL específicas de WT1 como un indicador.

El presente inventor clasificó después las células precursoras de CTL específicas de WT1 con precisión con respecto a la función y descubrió que, en particular, la célula precursora de CTL de tipo efector (en lo sucesivo en este documento, puede denominarse simplemente "célula efectora") existe en proporción más alta entre células precursoras de CTL. Este resultado indicó que la selección de pacientes altamente sensibles a vacuna de WT1 o diagnóstico de cáncer también puede llevarse a cabo basándose en la frecuencia de células precursoras de CTL específicas de WT1 del tipo efector como un indicador.

Además, el presente inventor midió la frecuencia de CTL específicos de WT1 en pacientes sometidos a tratamiento con un péptido antigénico tumoral ("péptido de WT1") derivado de WT1 y descubrió que el efecto terapéutico se correlaciona con el aumento de frecuencia de CTL después de la administración en relación con el obtenido antes de la administración.

La presente invención se ha establecido basándose en los hallazgos anteriores.

Por lo tanto, la presente invención proporciona lo siguiente:

(1) Un método in vitro para seleccionar un paciente altamente sensible a vacuna de WT1 que comprende las siguientes etapas (a) y (b) :

45 (a) medir la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 en una muestra... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para seleccionar un paciente altamente sensible a vacuna de WT1, que comprende las siguientes etapas (a) y (b) : 5

(a) medir la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 en una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo y

(b) comparar el valor medido de (a) con el de un sujeto sano y evaluar la sensibilidad a vacuna de WT1 usando como un indicador que la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 de (a) es 1, 5 veces o más la de un sujeto sano.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sensibilidad a vacuna de WT1 permite el diagnóstico de cáncer.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la medición de la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 se lleva a cabo por uno cualquiera de método de monómero de HLA, método de dímero de HLA, método de tetrámero de HLA, método de pentámero de HLA, método de ELISPOT, técnica de RT-PCR en tiempo real y método de dilución limitante.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la medición se lleva a cabo por método de tetrámero de HLA.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende las siguientes etapas (a) , (b) y (c) :

(a) poner un tetrámero de HLA que comprende un péptido antigénico de tumor derivado de WT1 en contacto con una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo;

(b) medir la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 unidas al tetrámero de HLA; y

(c) comparar el valor medido de (b) con el de un sujeto sano y evaluar la sensibilidad a vacuna de WT1, siendo el valor medido de (b) 1, 5 veces o más el de un sujeto sano.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la sensibilidad a vacuna de WT1 permite el diagnóstico de cáncer.

35 7. Un método para identificar una molécula diana de vacuna de WT1 siendo dicha molécula característica de un paciente, que comprende las siguientes etapas (a) , (b) y (c) :

(a) aplicar cada una de las moléculas diana plurales de vacuna de WT1 a una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un paciente de ensayo;

(b) medir la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 en las muestras biológicas respectivas de (a) y comparar los resultados entre sí; y

(c) identificar la molécula diana que mostró el mayor valor en (b) como la molécula diana de vacuna de WT1 eficaz para el paciente de ensayo.

45 8. El método de identificación de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la medición de la frecuencia de existencia

o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 se lleva a cabo por uno cualquiera de método de monómero de HLA, método de dímero de HLA, método de tetrámero de HLA, método de pentámero de HLA, método de ELISPOT, técnica de RT-PCR en tiempo real y método de dilución limitante.

9. El método de identificación de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la medición se lleva a cabo por método de tetrámero de HLA.

10. El método de identificación de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende las siguientes etapas (a) , (b) y (c) :

55 (a) poner cada uno de los tetrámeros de HLA plurales que comprenden diferentes péptidos antigénicos de tumor derivados de WT1 en contacto con una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un paciente de ensayo;

(b) medir la frecuencia de existencia o cantidad de células precursoras de CTL específicas de WT1 unidas a los tetrámeros de HLA respectivos y comparar los resultados entre sí; y

(c) identificar el péptido antigénico de tumor derivado de WT1 contenido en el tetrámero de HLA que mostró el mayor valor en (b) como el péptido antigénico de tumor derivado de WT1 eficaz para el paciente de ensayo.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 5, 6 ó 10, en el que la etapa (b) se lleva a cabo midiendo la proporción de células unidas a tetrámero de HLA entre CTL o células precursoras de CTL positivas para CD8 o 65 positivas para CD8/CD3.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células precursoras de CTL son células precursoras de CTL de tipo efector.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende las siguientes etapas (a) , (b) y (c) : 5

(a) poner un tetrámero de HLA que comprende un péptido antigénico de tumor derivado de WT1, un anticuerpo anti-CD8, un anticuerpo anti-CD45RA y un anticuerpo anti-CD27 en contacto con una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo;

(b) medir la proporción de células precursoras de CTL positivas para CD45RA y negativas para CD27 de tipo

efector entre células precursoras de CTL que son positivas para CD8 o CD8/CD3 y positivas para unión con tetrámero de HLA; y (c) comparar el resultado medido de (b) con el de un sujeto sano y evaluar la sensibilidad a vacuna de WT1, siendo el valor medido de (b) 1, 5 veces o más el de un sujeto sano.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, 9 a 12 en el que el antígeno de HLA como componente de tetrámero de HLA es un antígeno de HLA-A24 o un antígeno de HLA-A2.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el péptido antigénico de tumor derivado de WT1 se selecciona de los siguientes péptidos:

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEC ID Nº : 2) ; Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEC ID Nº : 3) ; y Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (SEC ID Nº : 5) .

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que se lleva a cabo usando citometría de flujo.