Método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular.

Un método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de una suspensión de células productoras

, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) lisado de las células en dicha suspensión celular;

b) precipitación selectiva del ADN de la célula huésped separándolo de las partículas de adenovirus por adición de bromuro de domifeno en una concentración de 1,3 a 2,2 mM;

c) clarificación de dicha suspensión que contiene dichas partículas de adenovirus para obtener una suspensión que contiene adenovirus purificada, en la que al menos el 80 % del ADN de la célula huésped se ha separado por precipitación de la suspensión que contiene adenovirus;

estando el método caracterizado porque la densidad celular de dicha suspensión celular varía de 10 x 106 a 50 x 106 células/ml.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/065430.

Solicitante: CRUCELL HOLLAND B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: ARCHIMEDESWEG 4 2333 CN LEIDEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: DE VOCHT,MARCEL LEO, VEENSTRA,MARLOES.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los... > C12N7/02 (Aislamiento o purificación)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/861 (Vectores adenovirales)

PDF original: ES-2472429_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Mïtodo para la purificaciïn de partïculas de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular

La invenciïn se refiere al campo de la producciïn de virus. Mïs en particular, se refiere a mïtodos mejorados para la purificaciïn de partïculas de adenovirus a partir de una suspensiïn celular.

Antecedentes de la invenciïn Los ïltimos avances en el campo de la producciïn de vacunas han creado la necesidad de preparaciones a gran escala. Se necesitan procesos fiables y de alto rendimiento para proporcionar al mundo la suficiente cantidad de vacunas (recombinantes) para combatir las enfermedades infecciosas.

Algunas vacunas contra enfermedades infecciosas pueden basarse en partïculas de adenovirus recombinantes. Por

este motivo, se estïn haciendo grandes esfuerzos para optimizar los procesos para la producciïn de adenovirus a base de cïlulas. Las densidades de cultivo de las cïlulas que subsiguientemente se infectan se estïn aumentando para obtener mayores rendimientos totales de virus. Tales procesos de alta densidad celular se desvelan, por ejemplo, en el documento WO 2010/060719 de Crucell Holland BV y en Yuk y col. (2004) . En estos documentos se describe un proceso para la producciïn de grandes concentraciones de adenovirus recombinantes. Este proceso optimizado se basa en la posibilidad de infectar cultivos de alta densidad celular (por ejemplo, mayor que 5 x 106 cïlulas/ml) , manteniendo una alta productividad de virus por cïlula. Con ello, se ofrece un mïtodo para la obtenciïn de una disoluciïn de virus cosechada con alta concentraciïn de virus en un ïnico biorreactor. Los rendimientos de partïculas vïricas (PV) tïpicos de dichos procesos son de aproximadamente 1, 5-2, 5 x 1012 PV/ml.

Los procesos en los que las cïlulas se cultivan a altas densidades son propensos a la acumulaciïn de grandes cantidades de restos celulares y de ADN de las cïlulas huïsped. Estos contaminantes deben desecharse mïs adelante en el proceso de purificaciïn, lo que es una operaciïn engorrosa. Con anterioridad, en el documento US 7326555 se desvelï un mïtodo para desechar el ADN de las cïlulas huïsped de un cultivo celular cosechado. El mïtodo consiste en la precipitaciïn selectiva del ADN de las cïlulas huïsped separïndolo del cultivo celular. Un agente de precipitaciïn selectiva pudo unirse especïficamente al ADN de las cïlulas huïsped y dejar las partïculas de adenovirus sin precipitar. Sin embargo, el mïtodo en esta referencia solo se ha descrito para cultivos celulares de baja densidad celular, en los que los restos celulares y el ADN de las cïlulas huïsped estïn presentes en bajas cantidades.

Hasta ese momento no se sabïa que dicho mïtodo pudiera aplicarse en un cultivo con altas densidades celulares. Por el contrario, del estado de la tïcnica podïa deducirse fundadamente que un agente precipitante, como el usado en dicho mïtodo, no precipitarïa selectivamente el ADN de la cïlula huïsped separïndolo del cultivo y precipitarïa las partïculas del virus al usarlo en altas concentraciones (Goerke y col. 2004) .

La publicaciïn Biotechnology and Bioengineering, vol. 90, 2005, 645-655, desvela la posibilidad cultivar cïlulas PER.C6 a densidades de aproximadamente 9 x 106 cïlulas/ml, la infecciïn de las mismas con adenovirus, la obtenciïn de los adenovirus por un proceso de lisis con detergente y la eliminaciïn posterior de los restos celulares por centrifugaciïn. La infecciïn de las cïlulas cultivadas a la densidad indicada con adenovirus resultï en una elevada productividad volumïtrica de virus, aunque la productividad especïfica de las cïlulas se redujo (vïase el

pïrrafo que conecta las pïginas 652-653) .

Dado que la escala de los procesos de los cultivos celulares se estï aumentando y las cïlulas se cultivan a densidades crecientes, en la industria existe la necesidad de procesos posteriores que hagan posible el tratamiento de suspensiones celulares de alta densidad. Esto se aplica en particular al campo de la producciïn de adenovirus.

Sumario de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a mïtodos para la purificaciïn de partïculas de adenovirus a partir de un lisado celular de una suspensiïn de alta densidad celular. En este trabajo, hemos encontrado que el ADN de las cïlulas 55 huïsped en suspensiones de alta densidad celular podïa precipitarse selectivamente separïndolo de la suspensiïn celular lisada y dejando las partïculas vïricas sin precipitar. La precipitaciïn selectiva del ADN de las cïlulas huïsped se llevï a cabo con bromuro de domifeno.

La precipitaciïn selectiva en suspensiones de baja densidad celular ha sido descrita con anterioridad, por ejemplo, en el documento US 7326555. Sin embargo, el logro de la precipitaciïn selectiva en una suspensiïn de alta densidad celular no tiene precedente y fue en gran medida inesperado. De hecho, en el estado de la tïcnica, por ejemplo, en el documento US 7326555, se demostrï que, en suspensiones de baja densidad celular (de hasta 1 x106 cïlulas/ml) , las partïculas de adenovirus precipitaban al aumentar la concentraciïn de detergente catiïnico. Como extrapolaciïn, esto sugiere que un aumento sustancial de la concentraciïn de detergente catiïnico (por

ejemplo, por un factor de 2) conducirïa a la precipitaciïn de la totalidad de las partïculas de adenovirus presentes en la suspensiïn.

En suspensiones de alta densidad celular, en las que la densidad celular es, por ejemplo, diez veces superior y por lo tanto la concentraciïn de ADN de las cïlulas huïsped es diez veces superior, es de esperar que la concentraciïn de detergente requerida para conseguir la precipitaciïn del ADN de las cïlulas huïsped sea tambiïn significativamente superior. Por consiguiente, a partir de los resultados de las suspensiones de baja densidad, se esperarïa que un aumento tal de la concentraciïn de detergente tuviera el efecto de precipitar todas las partïculas vïricas presentes en la disoluciïn.

Durante las pruebas experimentales con altas densidades celulares (aumentadas por un factor de 10) , encontramos que, en oposiciïn a cualquier sugerencia o expectativa basada en el estado de la tïcnica, la concentraciïn aumentada de bromuro de domifeno (aumentada por un factor de 2, 5) precipitaba el ADN de las cïlulas huïsped (al menos en el 80 %) , pero no precipitaba las partïculas de adenovirus. Sorprendentemente, el efecto de precipitaciïn selectiva del bromuro de domifeno se mantuvo. Con ello, la presente invenciïn proporciona un proceso que puede usarse para desechar el ADN de las cïlulas huïsped en procesos de purificaciïn de adenovirus a gran escala con el

uso de cultivos de alta densidad celular.

La invenciïn es la siguiente:

1. Un mïtodo para la purificaciïn de partïculas de adenovirus a partir de una suspensiïn celular productora, 20 comprendiendo dicho mïtodo las etapas de:

a) lisado de las cïlulas en dicha suspensiïn celular;

b) precipitaciïn selectiva del ADN de las cïlulas huïsped separïndolo de las partïculas de adenovirus por adiciïn de 25 bromuro de domifeno en una concentraciïn de 1, 3 a 2, 2 mM;

c) clarificaciïn de dicha suspensiïn que contiene dichas partïculas de adenovirus para obtener una suspensiïn purificada que contiene adenovirus, en la que al menos el 80 % del ADN de las cïlulas huïsped se ha separado por precipitaciïn de la suspensiïn que contiene adenovirus;

estando el mïtodo caracterizado porque la densidad celular de dicha suspensiïn celular varïa de 10 x 106 a 50 x 106 cïlulas/ml.

2. Un mïtodo de acuerdo con 1, en el que la densidad celular varïa de aproximadamente 10 x 106 a 30 x 106 35 cïlulas/ml y la concentraciïn de bromuro de domifeno... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un mïtodo para la purificaciïn de partïculas de adenovirus a partir de una suspensiïn de cïlulas productoras, comprendiendo dicho mïtodo las etapas de:

a) lisado de las cïlulas en dicha suspensiïn celular;

b) precipitaciïn selectiva del ADN de la cïlula huïsped separïndolo de las partïculas de adenovirus por adiciïn de bromuro de domifeno en una concentraciïn de 1, 3 a 2, 2 mM;

c) clarificaciïn de dicha suspensiïn que contiene dichas partïculas de adenovirus para obtener una suspensiïn que contiene adenovirus purificada, en la que al menos el 80 % del ADN de la cïlula huïsped se ha separado por precipitaciïn de la suspensiïn que contiene adenovirus;

estando el mïtodo caracterizado porque la densidad celular de dicha suspensiïn celular varïa de 10 x 106 a 50 x 106 cïlulas/ml.

2. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que la densidad celular varïa de aproximadamente 10 x 106 a x 106 cïlulas/ml y la concentraciïn de bromuro de domifeno (BD) varïa de 1, 3 a 2 mM. 20

3. Un mïtodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho mïtodo comprende ademïs una etapa de intercambio aniïnico y una etapa de ultrafiltraciïn.