Método para producir proteínas dependientes de vitamina K biológicamente activas por métodos recombinantes.

Un método para producir un producto de proteína de Factor IX recombinante biológicamente activo, que comprende las etapas de:

transfectar una célula CHO, con un gen que codifica el producto de proteína de Factor IX unido de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-5 α de hámster chino

(CHEF-1), y al menos dos genes o bien de forma simultánea o secuencial; y

cosechar el producto de proteína de Factor IX,

por lo que la célula produce producto de proteína de Factor IX biológicamente activo, como se mide con referencia al Factor IX estándar Mononine, en una cantidad de al menos 15 mg/L; y en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epóxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR), y un gen que codifica γ- glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/048954.

Solicitante: CNJ HOLDINGS, INC.

Nacionalidad solicitante: Canadá.

Dirección: 155 Innovation Drive Winnipeg, MB R3T 5Y3 CANADA.

Inventor/es: DROHAN, WILLIAM, N., GRIFFITH, MICHAEL, J., TAYLOR, JOHN R., STAFFORD,DARREL W.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/57 (que actúan sobre los enlaces peptídicos (3.4))

PDF original: ES-2503365_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para producir proteínas dependientes de vitamina K biológicamente activas por métodos recombinantes Fundamento de la invención Campo de la invención

Las realizaciones de la invención se refieren generalmente a la producción de proteínas dependientes de vitamina K recombinantes, particularmente Factor IX, que son totalmente funcionales por co-expresión de una o más proteínas implicadas en el procesado de las proteínas dependientes de vitamina K. Estas proteínas de procesado incluyen, epóxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR) y y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC). Adicionalmente, el propéptido de la proteína dependiente de vitamina K puede modificarse para mejorar la y- carboxilación.

Descripción de la técnica relacionada

Los trastornos de sangrado pueden resultar de una deficiencia en los niveles funcionales de una o más de las proteínas de la sangre, conocidas en conjunto como factores de coagulación de la sangre, que se necesitan para la hemostasia normal, es decir, coagulación de la sangre. La gravedad de un trastorno de sangrado dado es dependiente del nivel en sangre de factores de coagulación funcionales. Los trastornos de sangrado suaves se observan generalmente cuando el nivel funcional de un factor de coagulación dado alcanza aproximadamente el 5% de lo normal, aunque si el nivel funcional cae por debajo de 1%, es probable que ocurra sangrado grave con cualquier daño de la vasculatura.

La experiencia médica ha mostrado que la hemostasia esencialmente normal puede restaurarse temporalmente por infusión intravenosa de preparados biológicos que contienen uno o más de los factores de coagulación de la sangre. La denominada terapia de sustitución, en donde un preparado biológico que contiene el factor de coagulación de la sangre deficiente se infunde cuando se da el sangrado (bajo demanda) o para evitar el sangrado (profilácticamente), se ha mostrado que es efectivo en el manejo de pacientes con una amplia variedad de trastornos de sangrado. En general, para que la terapia de sustitución sea efectiva, las infusiones intravenosas del factor de coagulación ausente están dirigidas a alcanzar niveles que estén bien por encima de 5% de lo normal durante un periodo de dos a tres días.

Históricamente, los pacientes que sufren de hemofilia, un trastorno del sangrado adquirido genéticamente que resulta de una deficiencia o bien del Factor VIII de coagulación de la sangre (hemofilia A) o del Factor IX (hemofilia B), se trataban con éxito mediante infusión periódica de toda la sangre o fracciones de plasma sanguíneo de grados variables de pureza.

Más recientemente, con el advenimiento de la biotecnología, los preparados biológicamente activos de factores de coagulación de la sangre sintéticos (recombinante) se han convertido en disponibles comercialmente para el tratamiento de trastornos de coagulación de la sangre. Las proteínas de coagulación de la sangre recombinantes están esencialmente libres de riesgos de la contaminación patógena humana que continua siendo una preocupación que se asocia con preparados comerciales incluso de alta pureza que se derivan de la sangre humana.

El tratamiento adecuado de los trastornos de sangrado está muy limitado a las regiones económicamente desarrolladas del mundo. En el caso de hemofilia se estima que más del 75% de la población mundial de pacientes recibe tratamiento inadecuado o, peor, ningún tratamiento, para su enfermedad. Para muchas regiones del mundo, el coste de preparados comerciales seguros y efectivos de factores de coagulación es prohibitivo para el manejo rutinario de los trastornos de sangrado y, en algunos casos, solo el tratamiento de emergencia con productos donados está disponible.

En regiones del mundo donde el tratamiento adecuado de trastornos de sangrado está potencialmente disponible, el coste es muy alto y los pacientes son casi siempre dependientes de pagadores de tercera parte, por ejemplo, seguro de salud o programas subsidiarios del gobierno, para adquirir los productos comerciales necesarios. En promedio, el tratamiento de hemofilia en los Estados Unidos se estima que cuesta aproximadamente $5. por paciente por año por el producto comercial necesario para cuidado rutinario, bajo demanda. Sin embargo, este coste podría ser mucho mayor en tanto que el Comité Consultivo Médico y Científico para la Fundación Nacional de la Hemofilia ha recomendado que los pacientes deberían recibir tratamiento profiláctico que, en el caso de un hemofílico adulto, podría llevar al coste anual muy por encima de $25. por año. Dado que los límites de seguros de vida de aproximadamente $1 millón están asociados generalmente con la mayoría de políticas en los Estados Unidos, los hemofílicos se reducen gravemente en términos de la cantidad de producto comercial que pueden permitirse para el cuidado que, al menos, afecta a su calidad de vida durante la edad adulta y, a lo peor, eleva el riesgo de sangrado que amenaza la vida.

Durante los pasados 25 años o así, la biotecnología ha ofrecido la promesa de producir productos biofarmacéuticos a bajo coste. Desafortunadamente, esta promesa no se ha cumplido debido en mayor parte a la inherente complejidad de las moléculas biológicas que se dan de forma natural y una variedad de limitaciones asociadas con

la síntesis de sus contrapartes de proteína recombinante en células diseñadas genéticamente. A pesar del tipo de célula, por ejemplo, animal, bacteria, levadura, insecto, planta, etc., que se elige para la síntesis, las proteínas deben alcanzar ciertas propiedades estructurales mínimas para el uso terapéutico seguro y efectivo. En algunos casos, las proteínas recombinantes deben simplemente doblarse correctamente después de la síntesis para obtener la estructura tridimensional necesaria para la función apropiada. En otros casos, las proteínas recomblnantes deben sufrir modificación post-traduccional, dirigida por enzima, extensiva, después de que la proteína del núcleo se ha sintetizado en la célula. Deficiencias en cualquiera de un número de actividades enzimáticas intracelular pueden dar por resultado la formación de un gran porcentaje de proteína no funcional y limitar la utilidad de un sistema celular diseñado genéticamente para la producción económica de un producto biofarmacéutico previsto para uso comercial.

Varias de las proteínas necesarias para la coagulación normal de la sangre son muy complejas en término de tener dominios estructurales múltiples estando cada uno asociado con una propiedad funcional muy específica que es esencial para la efectividad total de la proteína en el control de la hemostasia y/o prevención de la trombosis. En particular, las denominadas proteínas de coagulación de la sangre "dependientes de vitamina K", por ejemplo, Factores II, Vil, IX, X, Proteína C y Proteína S, son proteínas muy complejas y deben sufrir modificación post- traduccional extensiva para la función normal. Alcanzar altos niveles de proteínas dependientes de vitamina K funcionales por tecnología recombinante se ha limitado por la complejidad estructural de estas proteínas y la incapacidad de crear sistemas celulares diseñados genéticamente que vencen las deficiencias inherentes en las actividades enzimáticas necesarias para que ocurra la modificación post-traduccional eficiente y completa.

Problema a resolver

La primera proteína de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K sintética en llegar a estar disponible comercialmente fue el Factor IX que se fabrica aún hoy en día a partir de células de Ovario de Flámster Chino (CHO) diseñadas genéticamente (BeneFix, Injerto Direccional del Factor IX de Coagulación (Recombinante), Weyth Pharmaceuticals, Inc. Filadelfia, PA 1911 Cl... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir un producto de proteína de Factor IX recombinante biológicamente activo, que comprende las etapas de:

transfectar una célula CHO, con un gen que codifica el producto de proteína de Factor IX unido de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hámster chino (CHEF-1), y al menos dos genes o bien de forma simultánea o secuencial; y

cosechar el producto de proteína de Factor IX,

por lo que la célula produce producto de proteína de Factor IX biológicamente activo, como se mide con referencia al Factor IX estándar Mononine, en una cantidad de al menos 15 mg/L; y en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epóxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR), y un gen que codifica y- glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC).

2. El método según la reivindicación 1, en donde al menos uno de los genes se sobre-expresa.

3. El método según la reivindicación 2, en donde el gen sobre-expresado se une de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hámster chino (CHEF1).

4. El método según la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente 75% de los residuos de ácido glutámico en el dominio gla del producto de proteína de Factor IX biológicamente activo están gamma carboxilados.

5. El método según cualquier reivindicación anterior, en donde al menos 5%, al menos 7% o al menos 8% de la proteína de Factor IX es biológicamente activa.

6. El método según cualquier reivindicación anterior, en donde la proteína de Factor IX biológicamente activa se produce en una cantidad de al menos 2 mg/L.

7. El método según cualquier reivindicación anterior, en donde la transfecclón es secuencial y en donde transfectar la célula de mamífero comprende además:

seleccionar células que expresan altos niveles del producto de proteína de Factor IX, VKOR O VKGC; clonar las células seleccionadas; y amplificar las células clonadas.

8. El método según la reivindicación 7, en donde la etapa de transfecclón con los al menos dos genes se realiza antes de la etapa de transfección con el gen que codifica la proteína de Factor IX.

9. El método según la reivindicación 7, en donde la etapa de transfecclón con el gen que codifica la proteína de Factor IX se realiza antes de la etapa de transfección con los al menos dos genes.

1. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la célula CHO se selecciona para expresión de niveles endógenos de uno o más factores de procesado antes de la transfección.

11. Una célula CHO recombinante, que comprende un gen que codifica una proteína de Factor IX unida de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hámster chino (CHEF-1) y al menos dos genes,

en donde la célula produce proteína FIX biológicamente activa en una cantidad de al menos 15 mg/L, como se mide con referencia al Factor IX estándar Mononine,

en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epóxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR) y un gen que codifica y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC).

12. La célula recombinante según la reivindicación 11, en donde al menos un gen se sobre-expresa.

13. La célula recombinante según la reivindicación 12, en donde el producto génico sobre-expresado está unido de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hámster chino (CHEF1).

14. Un método para producir un producto de proteína de Factor IX recombinante biológicamente activo, que comprende las etapas de:

(a) transfectar una célula CHO, con un gen que codifica la proteína de Factor IX unida de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hámster chino (CHEF1);

(b) seleccionar células que expresan altos niveles del producto de proteína de Factor IX;

(c) transfectar las células seleccionadas con al menos dos genes, en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epóxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR), y un gen que codifica y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC);

(d) repetir la etapa (b);

(e) opcionalmente, repetir las etapas (a) y/o (c) seguido por (b);

(f) clonar las células seleccionadas;

(g) hacer crecer las células clonadas; y

(h) cosechar el producto de proteína de Factor IX a partir de las células clonadas en una cantidad de al menos 15 mg/L.