Método para producir un éster de proteína o un éster de subunidad de proteína.

Un método para producir un éster de proteína y/o éster de subunidad de proteína,

método que comprende mezclar un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua para producir un entorno con alto contenido en agua que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido y dicho aceptor de acilo es una proteína y/o subunidad de proteína; y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:

i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;

ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;

iii) calentar el sustrato hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0,25ml de disolución de enzima;

iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 μl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;

v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45μm en un vaso Dram de 10ml tarado;

vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y escalar las muestras;

vii) analizar el lípido extraído por GLC.

Método para producir un éster de proteína o un éster de subunidad de proteína Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para la bioconversión de lípidos para producir un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína por el uso de una lípido aciltransferasa.

La presente invención se refiere además al uso de una lípido aciltransferasa para bioconvertir un lípido en un éster de proteína y/o de subunidad de proteína.

La presente invención se refiere además al uso de una lípido aciltransferasa inmovilizada- como se define en la presente memoria en métodos y usos de la presente invención.

Antecedentes técnicos Las lipasas se han usado extensamente en la bioconversión de lípidos para preparar productos con un valor alto, por ejemplo ésteres de azúcar, para uso en un amplio rango de industrias, incluyendo las industrias alimentaria y/o de piensos, las industrias de cosméticos y/o cuidado de la piel, la industria oleoquímica y la industria farmacéutica.

Cuando los procesos de bioconversión requieren la hidrólisis de sustratos lipídicos, pueden usarse enzimas lipolíticas en entornos con alto contenido en agua. Sin embargo, cuando los procesos de bioconversión requieren reacciones de interesterificación o transesterificación tales como por alcoholisis, el uso de lipasas en entornos con alto contenido en agua puede ser perjudicial debido a reacciones de hidrólisis no deseadas, que resultan en bioproductos no deseados y/o rendimientos menores del producto de bioconversión.

Típicamente, los procesos de bioconversión que requieren interesterificación y/o transesterificación han utilizado lipasas en entornos no acuosos tales como sistemas de aceite y/o sistemas de disolvente orgánico tales como en butanol, metanol o hexano. Dichos sistemas proporcionan un entorno en el que tanto la molécula aceptora polar como la molécula donante lipídica pueden estar al menos parcialmente solubilizadas, y la lipasa tiene actividad enzimática suficiente. Aunque para cualquier actividad enzimática se requiere una pequeña cantidad de agua, la cantidad de agua se mantiene estrictamente a un nivel bajo para evitar la actividad hidrolítica de la enzima.

Convencionalmente, los ésteres de azúcar, ésteres de proteína o ésteres de hidroxiácido se han producido por síntesis química usando catalizadores inorgánicos. Los procesos de bioconversión convencionales para la producción de ésteres de azúcar o ésteres de hidroxiácido utilizan lipasas en entornos de disolvente orgánico o fluidos supercríticos en los que sólo está presente (si lo está) una pequeña cantidad de agua.

Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No. 8 (agosto) , pp869-874 describen un estudio de varias enzimas lipasas y su actividad en un medio acuoso en la producción de éster de metilo o éster de butilo a partir de metanol y butanol, respectivamente. Lecointe et al enseñan una lipasa/aciltransferasa de Candida parapsilosis que al incrementar las concentraciones de metanol o butanol mostró una actividad de hidrólisis reducida y una capacidad aumentada de la enzima para producir éster de metilo y éster de butilo. El uso de una lipasa/aciltransferasa de C. parapsilosis en la producción de ácido graso hidroxámico se enseña en Vaysse et al J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46.

WO 00/05396 describe el uso de un agente de conversión para preparar a partir de un material alimenticio un producto alimenticio que comprende al menos un ingrediente funcional, en el que el al menos un ingrediente funcional se ha generado a partir de al menos un constituyente del material alimentario por el agente de conversión.

Las lipasa:colesterol aciltransferasas son conocidas desde hace un tiempo (véase por ejemplo Buckley -Biochemistr y 1983, 22, 5490-5493) . En particular, se han encontrado glicerofosfolípido:colesterol acil transferasas (referidas frecuentemente como GCAT) que, como las lecitina:colesterol aciltransferasas (LCAT) de plantas y/o mamíferos, catalizarán la transferencia de ácido graso entre fosfatidilcolina y colesterol.

Upton y Buckley (TIBS 20, mayo 1995 p 178-179) y Brumlik y Buckley (J. of Bacteriology abr. 1996 p 2060-2064) enseñan una lipasa/aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que tiene la capacidad de realizar la transferencia de acilo a aceptores alcohol en un medio acuoso.

Aspectos resumidos de la presente invención Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína, método que comprende mezclar un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua para producir un entorno con alto contenido en agua que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido y dicho aceptor de acilo es una proteína y/o una subunidad de proteína; y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación en el que la lípido

aciltransferasa es una que cuando se ensaya en el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:

i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;

ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;

iii) calentar el sustrato hasta 35º C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0, 25ml de disolución de enzima;

iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 μl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;

v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0, 45 μm en un vaso Dram de 10ml tarado;

vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60º C, y escalar las muestras;

vii) analizar el lípido extraído por GLC.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para producir un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína por catálisis de una o ambas de alcoholisis o transesterificación en una mezcla de un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua, mezcla que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido y dicho aceptor de acilo es una proteína y/o una subunidad de proteína, en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:

i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;

ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;

iii) calentar el sustrato hasta 35º C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0, 25ml de disolución de enzima;

iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 μl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;

v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0, 45 μm en un vaso Dram de 10ml tarado;

vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60º C, y escalar las muestras;

vii) analizar el lípido extraído por GLC.

Un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína pueden producirse por un método según la presente invención.

Un farmacéutico, un cosmético, un producto alimenticio, un producto de pienso, una pintura que comprende un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína pueden producirse por un método según la presente invención.

Una enzima lípido aciltransferasa inmovilizada como se define en la presente memoria... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un éster de proteína y/o éster de subunidad de proteína, método que comprende mezclar un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua para producir un entorno con alto contenido en agua que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del 5 grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido y dicho aceptor de acilo es una proteína y/o subunidad de proteína; y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:

i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;

ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;

iii) calentar el sustrato hasta 35º C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0, 25ml de disolución de 15 enzima;

iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 μl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;

v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0, 45μm en un vaso Dram de 10ml tarado;

vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60º C, y escalar las muestras;

vii) analizar el lípido extraído por GLC.

2. Un método según la reivindicación 1 en el que la lípido aciltransferasa está inmovilizada.

3. Un método según la reivindicación 1 o reivindicación 2 en el que el método comprende purificar el éster de proteína y/o éster de subunidad de proteína.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad acil transferasa y que comprende el resto de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

5. Un método según la reivindicación 1 en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:

(a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la Figura 9) ;

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la Figura 10) ;

(c) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la Figura 11) ;

(d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la Figura 12) ;

(e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la Figura 13) ; 35 (f) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la Figura 15) ;

(g) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la Figura 17) ;

(h) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la Figura 19) ;

(i) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la Figura 21) ;

(j) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la Figura 23) ; 40 (k) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la Figura 25) ;

(l) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la Figura 27) ;

(m) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la Figura 29) ;

(n) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la Figura 31) ;

(o) o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa se clasifica como E.C. 2.3.1.x.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa puede obtenerse de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SED ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32,

(xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 o SEQ ID No. 34.

9. Uso de una lípido aciltransferasa para producir un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína por catálisis de una o ambas de alcoholisis o transesterificación en una mezcla de un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua, mezcla que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido y dicho aceptor de acilo es una proteína y/o una subunidad de proteína, en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:

i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;

ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;

iii) calentar el sustrato hasta 35º C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0, 25ml de disolución de enzima;

iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 μl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;

v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0, 45 μm en un vaso Dram de 10ml tarado;

vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60º C, y escalar las muestras;

vii) analizar el lípido extraído por GLC.

10. Uso según la reivindicación 9 en el que la lípido aciltransferasa está inmovilizada.

11. Uso según la reivindicación 9 en el que el éster de proteína y/o éster de subunidad de proteína se purifica.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad acil transferasa y que comprende el resto de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

13. Uso según la reivindicación 9 en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:

(a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la Figura 9) ;

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la Figura 10) ;

(c) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la Figura 11) ;

(d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la Figura 12) ;

(e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la Figura 13) ;

(f) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la Figura 15) ;

(g) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la Figura 17) ;

(h) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la Figura 19) ;

(i) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la Figura 21) ;

(j) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la Figura 23) ;

(k) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la Figura 25) ;

(l) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la Figura 27) ;

(m) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la Figura 29) ;

(n) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la Figura 31) ;

(o) o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ

ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en el que la lípido aciltransferasa se clasifica como E.C.

2.3.1.x.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-14 en el que la lípido aciltransferasa puede obtenerse de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-15 en el que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SED ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix)

la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5,

SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 o SEQ ID No. 34.