METODO PARA PRODUCIR COMPUESTOS DE FENILALANINA OPTICAMENTE ACTIVOS A PARTIR DE DERIVADOS DE ACIDO CINAMICO QUE EMPLEA UNA FENILALANINA AMONIACO LIASA DERIVADA DE IDIOMARINA LOIHIENSIS.

Proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido por reacción del ácido cinámico correspondiente con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con SEQ ID NO. 4

Método para producir compuestos de fenilalanina ópticamente activos a partir de derivados de ácido cinámico que emplea una fenilalanina amoniaco liasa derivada de Idiomarina loihiensis.

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido en el cual el derivado de ácido cinámico correspondiente se hace reaccionar con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva.

Los compuestos de fenilalanina enantioméricamente enriquecidos son compuestos intermedios importantes para, por ejemplo, productos farmacéuticos, en particular en la preparación de inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina I (ACE), que se utilizan para el tratamiento de la presión sanguínea elevada (hipertensión). El ácido (S)-indolina-2-carboxílico ópticamente activo, que puede prepararse por cierre de anillo de (S)-2-clorofenilalanina, por ejemplo, puede utilizarse en la preparación de ácido [2S-[1[R*(R*)-2a,3aß,7aß]]-1-[2-[[1-(etoxicarbonil)butil]amino]-1-oxopropil]octahidro-1H-indol-2-carboxílico, conocido también bajo el nombre comercial Perindopril, que es útil como antihipertensivo (inhibidor de la ACE) o ingrediente cardiotónico activo. Otras aplicaciones útiles son, por ejemplo, Pentopril e Indolapril.

Un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido es conocido por WO2006/069799 A1, en donde en un ejemplo específico se prepara ácido (S)-2-amino-3-(2-cloro-fenil)-propiónico por reacción de ácido 3-(2-cloro-fenil)acrílico con NH₃ acuoso en presencia de fenilalanina-amoniaco-liasa (PAL) de R. glutinis. La secuencia de aminoácidos de PAL de Rhodotorula glutinis puede encontrarse en WO01/11071 A2 y en SEQ ID NO. 9 en esta memoria.

Una desventaja del proceso que se describe en WO2006/069799 A1 es que se produce inhibición de sustrato. Por esta razón, el proceso precisa ejecutarse a baja concentración. Para la producción de una cantidad aceptable de producto, se requieren por tanto grandes volúmenes o protocolos de alimentación complicados, lo que lo hace menos atractivo desde un punto de vista comercial.

Por esta razón, es el objeto de la presente invención proporcionar un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina en el cual se reduce la inhibición de sustrato.

Este objeto se ha conseguido por un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido por reacción del ácido cinámico correspondiente con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con SEQ ID NO. 4.

El proceso de la presente invención proporciona por tanto un proceso mejorado y/o comercialmente atractivo para la preparación de un compuesto de fenilalanina. La inhibición de sustrato, es decir - una disminución en la actividad inicial de la enzima por aumento en la concentración de sustrato -, se reduce por utilización de una PAL que tiene al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4. Adicionalmente, las fenilalanina-amoniaco-liasas (PALs) que tienen al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4 se sobre-expresan fácilmente en E. coli. Otra ventaja de las PALs que tienen al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4 en comparación con PAL de R. glutinis es que las mismas tienen mayor actividad.

El % de identidad como se define en esta memoria se determina en estudios de alineación de secuencias utilizan-do

Clone Manager 6 (versión 6.00/Align Plus 4, versión 4.10 (Scientific & Educational Software) utilizando BLOSUM62 como matriz de registro.

Preferiblemente, en el proceso de la presente invención, la PAL utilizada tiene una identidad de secuencia de al menos 50%, más preferiblemente al menos 53%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 57%, aún más preferiblemente al menos 60%, todavía más preferiblemente al menos 62%, todavía más preferiblemente al menos 65%, todavía más preferiblemente al menos 70%, en particular al menos 75%, de modo más particular al menos 80%, de modo más particular al menos 85%, de modo más particular al menos 90%, de modo aún más particular al menos 95%, de modo aún más particular al menos 97%, de modo todavía más particular al menos 98%, de modo todavía más particular al menos 99%, y muy particularmente 100% con SEQ ID NO. 4.

Las secuencias de PAL que pueden utilizarse en el proceso de la presente invención pueden ser identificadas fácilmente por la persona experta en la técnica, utilizando por ejemplo búsquedas BLAST en una base de datos, por ejemplo en la base de datos NCBI. Las secuencias de ácido nucleico que codifican estas secuencias PAL pueden identificarse fácilmente, por ejemplo por utilización de los programas disponibles vía BLAST en el NCBI. Alternativamente, partiendo de la secuencia de aminoácidos, puede sintetizarse también una secuencia de ácido nucleico en el uso de codones preferido u optimizado para la célula hospedadora deseada, por ejemplo por compañías comerciales tales como GenScript o DNA 2.0. La secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una enzima PAL utilizada en el proceso de la presente invención, puede clonarse en un vector adecuado y, después de introducción en un hospedador adecuado, la secuencia puede (sobre)expresarse de acuerdo con técnicas estándar de clonación y expresión, que son conocidas por la persona experta en la técnica (v.g., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para producir una enzima PAL que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 4.

En el marco de la invención, PAL (fenilalanina-amoniaco-liasa) se define como una enzima con actividad de fenilalanina-amoniaco-liasa, es decir la capacidad para catalizar la aminación reversible no reductora de ácido cinámico a fenilalanina. HAL (histidina-amoniaco-liasa) se define como una enzima con actividad de histidina-amoniaco-liasa, es decir la capacidad para catalizar la aminación reversible no reductora de ácido urocanoico a histidi-na.

Preferiblemente, el compuesto de fenilalanina producido en el proceso de la presente invención es un compuesto de fórmula (1) o una sal del mismo

en donde Y representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo ariloxi sustituido o no sustituido, o un grupo amina o un residuo amina -NHR en donde R es un grupo alquilo, aralquilo, arilo, alcarilo que comprende 1-10 átomos C y opcionalmente uno o más heteroátomos, y en donde Z representa uno o más sustituyentes en un grupo aromático que se seleccionan de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo amina, un grupo nitro, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, una amida carboxílica, o un grupo nitrilo o trifluorometilo. La sustitución opcional en el caso en que Z es un grupo alifático cíclico o acíclico, un grupo alifático heterocíclico, un grupo (hetero)arilo o un grupo alcoxi y en el caso en que Y es un grupo alcoxi o ariloxi puede seleccionarse por ejemplo de un trihalogenuro, por ejemplo trifluorometilo, triclorometilo; un átomo de halógeno, por ejemplo fluoruro, cloruro o yoduro; un grupo amina, por ejemplo metilamina, dimetilamina, bencilamina, etilamina, propilamina, fenilamina, 4-fluorofenilamina; un grupo alcoxi o ariloxi, por ejemplo metoxi, etoxi, isopropoxi, benciloxi, fenoxi, 4-fluorofenoxi, 3-fluorofenoxi, 2-fluorofenoxi; un tioéter, por ejemplo metiltioéter, etiltioéter, benciltioéter; un trihaloalquiléter, por ejemplo trifluorometiléter; un arilo o heteroarilo, por ejemplo, fenilo, 4-fluorofenilo, 3-fluorofenilo, 2-fluorofenilo, 2-trifluorometilfenilo, 3-trifluorometilfenilo, 4-trifluorometilfenilo, tiofeno, furano, pirazol, pirrol, imidazol, o análogos. Se prefieren compuestos en los cuales Z es hidrógeno, un átomo de halógeno,...

1. Proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido por reacción del ácido cinámico correspondiente con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con SEQ ID NO. 4.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el compuesto de fenilalanina es un compuesto de fórmula (1) o una sal del mismo

en donde Y representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo ariloxi sustituido o no sustituido, o un residuo amina y en donde Z representa uno o más sustituyentes en un grupo aromático que se seleccionan de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo amina, un grupo nitro, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, una amida carboxílica, o un grupo nitrilo o trifluorometilo.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto de fenilalanina es un compuesto de fórmula (2) o una sal del mismo

en donde Z representa uno o más sustituyentes en un grupo aromático que se seleccionan de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo amina, un grupo nitro, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, una amida carboxílica, un grupo nitrilo o trifluorometilo y en donde Y representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo ariloxi sustituido o no sustituido, o un residuo amina, y en donde X representa un grupo lábil, por ejemplo un grupo lábil seleccionado del grupo de halógeno, mesilato, nosilato, tosilato, triflato, ácido borónico, un grupo nitro y análogos.

4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde X representa cloruro o bromuro, Y representa hidroxilo y Z representa hidrógeno.

5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el compuesto de fórmula (1) es (S)-2-clorofenilalanina o (S)-2-bromofenilalanina.

6. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el donante de grupo amino es NH₃ o NH₄OH.

7. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva tiene la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 8.

8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende adicionalmente el paso de, someter a ciclación un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido, quiral y sustituido con X en orto, de acuerdo con la fórmula (2)

o una sal del mismo, en la cual Y y Z son como se define arriba y X es un grupo lábil, a una temperatura inferior a aproximadamente 140ºC, con lo cual se forma un compuesto de ácido indolina-2-carboxílico enantioméricamente enriquecido de acuerdo con la fórmula (3)

9. Proceso para la producción de un ingrediente farmacéutico activo, que comprende el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.