Método para la producción de proteínas recombinantes a partir de raíces pilosas de plantas.

Un método para secretar una proteína recombinante a partir de raíces pilosas que comprende las etapas de:

a) transformar una planta con una cepa de Agrobacterium rhizogenes y/o con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que comprende los genes rol; y

b) transformar dicha planta con un vector que contiene una casete de expresión que comprende un péptido señal y un gen que codifica dicha proteína recombinante;

en donde dicha planta pertenece a la familia Brassicaceae

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Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10305473.

Solicitante: UNIVERSITÉ DE PICARDIE JULES VERNE.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: CHEMIN DU THIL 80025 AMIENS FRANCIA.

Inventor/es: BOITEL-CONTI,MICHÈLE, HUET,YOANN, GUERINEAU,FRANÇOIS, ELE EKOUNA,JEAN-PIERRE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/04 (Células o tejidos vegetales)

PDF original: ES-2461941_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para la producción de proteínas recombinantes a partir de raíces pilosas de plantas Campo de la invención La invención se refiere a un método para la secreción de proteínas recombinantes a partir de raíces pilosas transgénicas, en particular raíces pilosas transgénicas obtenidas a partir de plantas pertenecientes a la familia Brassicaceae.

Antecedentes de la invención Las proteínas son biopolímeros de aminoácidos sintetizados por todos los organismos vivos. Están implicadas en prácticamente todos los aspectos de la vida de la célula. Las enzimas dirigen y regulan el metabolismo, las proteínas estructurales dan forma a las células, los receptores y las proteínas de señalización integran los cambios medioambientales. Hoy en día, las proteínas son utilizadas ampliamente no sólo en el campo industrial (enzimas en polvo de lavado, aditivos alimentarios, agentes de blanqueo de papel...) , sino también para aplicaciones médicas (vacunas y alérgenos, hormonas, anticuerpos...) . Antes del desarrollo de la biología molecular y de las herramientas de la tecnología de ADN recombinante, la única fuente de proteínas de interés se mantenía en el propio organismo productor. De hecho, la insulina fue purificada primeramente de cerdos, mientras que la hormona del crecimiento humana se extrajo de tejidos de cadáveres humanos. Los principales inconvenientes de estos enfoques eran la disponibilidad limitada de material de partida y el contenido bastante bajo de la proteína de interés. Por otra parte, el riesgo de contaminación viral relativa a proteínas con aplicaciones médicas se mantuvo alto, especialmente cuando se extrajeron de tejidos humanos. En los años 80, la tecnología de ADN recombinante proporcionó alternativas a este tipo de problemas al permitir la producción en exceso de proteínas foráneas (proteínas recombinantes) en un organismo anfitrión determinado. De hecho, la insulina animal fue la primera proteína recombinante con aplicación médica que fue producida en la bacteria E. coli. En el momento actual, los cultivos de células animales y E.coli son las dos referencias para la bioproducción de proteínas recombinantes.

Sin embargo, las bacterias son incapaces de producir proteínas complejas (glicosilada) y el cultivo de células animales es un procedimiento bastante caro que no puede excluir el riesgo de contaminación por virus animales. De este modo emergieron sistemas alternativos de bioproducción durante las últimas dos décadas, incluyendo plantas que se consideran que son seguras (no hay riesgo viral) , capaces de producir proteínas complejas y poco costosas para crecer. Se prefiere el confinamiento de los sistemas de bioproducción de origen vegetal (en invernaderos para toda la planta, o biorreactores para cultivos de células y órganos vegetales) a las plantas cultivadas en el campo. Las raíces pilosas son un ejemplo de tal sistema de bioproducción confinado, ya que se pueden cultivar fácilmente en biorreactores y se pueden obtener los clones transgénicos para cualquier gen de interés. Este sistema de raíces concreto se genera después de la infección de la célula vegetal por Agrobacterium rhizogenes que naturalmente transfiere diversos genes bacterianos (genes rol) al genoma de la planta. Estos genes rol obligan a la célula vegetal infectada (de la raíz, hoja ...) a seguir un nuevo programa de desarrollo que conduce a la formación en el lugar de la infección de un nuevo sistema radicular: las raíces pilosas. A. rhizogenes puede ser modificado genéticamente con el fin de realizar la transferencia de un gen de interés (que codifica un agente biofarmacéutico) para la producción de raíces pilosas transgénicas. El tabaco (Nicotiana tabacum) es, con mucho, la especie vegetal más utilizada en gran parte para la producción de proteína recombinante pero se demostró que otros eran adecuados (Daniell et al., Trends in Plant Science, 2009) . De hecho, es una especie bien caracterizada, que se utiliza principalmente en el ámbito académico y de la investigación aplicada. Se demostró que las raíces pilosas de Nicotiana tabacum eran capaces de producir y secretar no sólo la proteína GFP recombinante modelo sino también diversas proteínas relevantes para aplicaciones terapéuticas en la salud humana.

Por ejemplo, el trabajo previo de Medina-Bolívar (Medina-Bolívar et al., 2004) mostró la acumulación de eGFP en el medio de cultivo de raíces de Nicotiana tabacum a 0, 8 mg/L después de 21 días.

Más recientemente, Woods et al. (Woods, et al. 2008, BMC Biotechnology, 8:95) han producido acetilcolinesterasa humana a partir de cultivos de órganos de raíces pilosas de Nicotinia benthamiana.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a un método para obtener una proteína recombinante a partir de raíces pilosas que comprende las etapas de:

a) transformar una planta con una cepa de Agrobacterium rhizogenes y/o con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que comprenden los genes rol;

y

b) transformar dicha planta con un vector que contiene una casete de expresión que comprende un péptido señal y un gen que codifica dicha proteína recombinante;

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en donde dicha planta pertenece a la familia Brassicaceae.

También se describen cultivos de raíces pilosas obtenibles mediante las etapas de transformación descritas anteriormente.

La memoria descriptiva describe un medio de cultivo que contiene una proteína recombinante obtenible mediante el método descrito anteriormente.

La memoria descriptiva describe adicionalmente a una proteína recombinante obtenible mediante el método descrito anteriormente.

De hecho, los autores de la invención han descubierto que las raíces pilosas obtenidas mediante la transformación de una planta perteneciente a la familia Brassicaceae con Agrobacterium rhizogenes son capaces de secretar grandes cantidades de proteína recombinante al medio extracelular. Como alternativa, se puede sustituir Agrobacterium rhizogenes por Agrobacterium tumefaciens, en presencia de los genes rol, conocidos por inducir la formación de raíces pilosas.

Una ventaja de la presente invención es la simplificación de la recuperación y el procesamiento aguas abajo de la proteína recombinante. Otra ventaja es que la biomasa de las raíces no se destruye para la recuperación de proteínas y que se puede utilizar un cultivo dado para varios ciclos de producción de dicha proteína recombinante. A diferencia de las plantas cultivadas en campos en los que los factores ambientales (cambios de temperatura, sequía, ataques de plagas, uso plaguicidas/herbicidas ...) pueden afectar considerablemente al nivel de producción de la proteína recombinante, las condiciones de cultivo de raíces transgénicas en biorreactores están controladas y normalizadas que lleva a una producción homogénea entre los diferentes lotes. Por otra parte, las raíces no producen polen y no pueden sobrevivir fuera del biorreactor, lo que elimina el riesgo de difusión del transgén en el medio ambiente.

El uso de especies de plantas comestibles durante varios cientos de años en la nutrición humana/animal es un buen indicador de su naturaleza inofensiva. En contraste con el tabaco, que se ha utilizado ampliamente en el pasado para este tipo de aplicación, y que pertenece a la familia de las solanáceas bien conocida por la capacidad de varios de sus miembro de especies para producir compuestos potencialmente tóxicos (alcaloides) , incluyendo la nicotina.

El uso de un sistema de raíces de plantas comestibles para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas reduce de este modo los problemas de seguridad relacionados con la materia prima de partida antes de la purificación de las proteínas (sin virus... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para secretar una proteína recombinante a partir de raíces pilosas que comprende las etapas de:

a) transformar una planta con una cepa de Agrobacterium rhizogenes y/o con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que comprende los genes rol;

y

b) transformar dicha planta con un vector que contiene una casete de expresión que comprende un péptido señal y un gen que codifica dicha proteína recombinante;

en donde dicha planta pertenece a la familia Brassicaceae.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa a) y la etapa b) se realizan simultáneamente mediante la transformación de dicha planta perteneciente a la familia Brassicaceae con una cepa de Agrobacterium rhizogenes, en donde dicha cepa de Agrobacterium rhizogenes contiene una casete de expresión que comprende un gen que codifica dicha proteína recombinante.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha planta perteneciente a la familia Brassicaceae se selecciona del grupo que consiste en Raphanus sativus, Raphanus sativus var. niger, Brassica oleracea L. convar y Brassica rapa.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha planta perteneciente a la familia Brassicaceae es Brassica rapa.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha cepa de Agrobacterium rhizogenes es la cepa ATCC 25818.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha casete de expresión comprende un promotor, un péptido señal, un gen que codifica dicha proteína recombinante y una secuencia de poliadenilación.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho promotor es un promotor derivado de un virus que infecta plantas Brassicaceae.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho promotor es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) .

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicho péptido señal deriva de una planta de Brassicaceae.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho péptido señal es un péptido señal del péptido señal AT1G69940 de la pectina metilesterasa de Arabidopsis o una variante del mismo, tal como el péptido señal mostrado en el SEQ ID NO: 1.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en alérgenos, vacunas, enzimas, inhibidores de enzimas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, antígenos, toxinas, péptidos antimicrobianos, hormonas, factores de crecimiento, proteínas de la sangre (tales como albúmina, factores de coagulación, transferrina) , proteínas receptoras y de señalización, componentes proteicos de patrones biomédicos, componente proteicos de medios de cultivo celulares, proteínas de fusión o etiquetadas, péptidos y proteínas ricos en cisteína (puentes disulfuro) , y proteínas vegetales (tales como lectinas, papaína..) .