Método para la producción de un hidrolizado de caseína.

Metodo para la produccion de un hidrolizado de caseina, comprendiendo:

a) adicion de una endopeptidasa con al menos un 50% de identidad con la SEC 10 n.D: 1 a una co mposicion comprendiendo caseina, e

b) incubacion para hidrolizar la caseina.

Metodo para la produccion de un hidrolizado de caseina Referencia a un listado de secuencias [0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato legible por ordenador. El formato legible por ordenador se incorpora aqui por referencia. Campo tecnico [0002] La presente invencion se refiere a un m etodo para la produccion de un hi drolizado de caseina usando una endopeptidasa microbiana. Antecedentes de la invencion [0003] Los hidrolizados de caseina se usan para el enriquecimiento de las proteinas, por ejemplo, en bebidas para deportistas, y en otras bebidas dieteticas, bebidas en polvo, barritas nutritivas, formulas para lactantes, etc. Los hidrolizados de caseina en algunos casos han resultado ser menos alergenicos que los hidrolizados de proteina de suero, lo que los hace potencialmente mas utiles, por ejemplo, en formulas para lactantes. Los hidrolizados de caseina pueden ser fabricados usando enzimas proteoliticas para hidrolizar la caseina. En la fabricacion industrial de hidrolizados de caseina, la solubilidad alta o suspendibilidad de la proteina hidrolizada es importante, desde ambos, un punto de vista del proceso, desde un punto de vista puramente de rendimiento/economico y por una sensacion en la boca y propiedades sensoriales. Ha sido por lo tanto objeto de los presentes inventores identificar enzimas proteoliticas que son utiles para preparar hidrolizados de caseina con una alta solubilidad, tal como una alta solubilidad con pH bajo y/o una alta solubilidad con un grado de hidrolisis bajo o moderado. [0004] Las endopeptidasas que han resultado ser aplicables segun la presente invencion han sido descritas previamente. Por ejemplo, la endopeptidasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 se divulga en el documento W088/03947 (aqui se hace referencia a la cepa como cepa Nocardiopsis sp. 10R) y el documento W001/58276. 0tras endopeptidasas relacionadas que s on utiles segun la invencion se describen en l os documentos W088/03947, W004/111220, W004/111222, W004/111223, W005/123911 y W004/072279. [0005] El documento W0 03/007730 divulga un proceso comprendiendo proteina de caseina hidrolizada con una endoproteasa especifica de prolina. Resumen de la invencion [0006] Los presentes inventores han identificado endopeptidasas que han resultado ser aplicables en la produccion de hidrolizados de caseina con una alta solubilidad y que dan lugar a suspensiones uniformes. Tales endopeptidasas son funcionalmente mas eficaces que otras endopeptidasas usadas en la tecnica, cuando se comparan con una misma cantidad de proteinas enzimaticas, lo que resulta en una economia de producto mejor para los productores de hidrolizados de caseina. Consecuentemente, la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de un hidrolizado de caseina, comprendiendo: a) adicion de una endopeptidasa con al menos un 50% de identidad con la SEC 10 n.D: 1 a una composicion comprendiendo caseina y b) incubacion para hidrolizar la caseina. 0escripcion detallada de la invencion Endopeptidasa [0007] El termino endopeptidasa como se utiliza en este caso es una enzima que hidroliza enlaces peptidicos internos (tiene actividad de endopeptidasa) . [0008] No hay limitaciones en el origen de la endopeptidasa para uso segun la invencion. Asi, el termino endopeptidasa incluye no solo endopeptidasas naturales o de tipo salvaje, sino tambien cualquier mutante, variantes, fragmentos, etc., de las mismas, que exhibe actividad de endopeptidasa, al igual que endopeptidasas sinteticas, tal como endopeptidasas redistribuidas. Variantes d e e ndopeptidasa geneticamente modificada se p ueden preparar como se co noce generalmente en la tecnica, por ejemplo, por mutagenesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR con la mutacion deseada como uno de los cebadores en las reacciones PCR) , o por mutagenesis aleatoria. Ejemplos de variantes de endopeptidasa, como se usan en el presente contexto, son endopeptidasas en el que uno o mas aminoacidos han sido eliminados, insertados o sustituidos por otros aminoacidos. [0009] Ejemplos de endopeptidasas para uso segun la invencion son

(i) la endopeptidasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, divulgada en el documento W001/58276, cuya secuencia se muestra como SEC 10 n.D: 1 del presente documento;

(ii) en dopeptidasas con al menos 50, 55 , 60, 65, 70, 75, 80, 8 5, 9 0 o al m enos 95% de identidad d e aminoacido con la endopeptidasa de (i) ;

(iii) m utantes, va riantes o f ragmentos de l as endopeptidasas de ( i) o ( ii) ex hibiendo act ividad de endopeptidasa.

P ara los fines de l a p resente i nvencion, el alineamiento de dos secuencias de am inoacidos puede ser determinado usando el programa Needle del paquete EMB0SS (http://emboss.org) version 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo dealineacion globaldescrito en Needleman, S. B. and Wunsch, C. 0. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitucion usada es BL0SUM62, la penalizacion de abertura del espacio es 10, y la penalizacion de extension de espacio es 0.5.

El grado de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se calcula como el numero de correspondencias exactas en una alineacion de las dos secuencias, dividido por la longitud de la mas corta de las dos secuencias. El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

Una correspondencia exacta ocurre cuando las dos secuencias tienen residuos de aminoacidos identicos en las mismas posiciones de la coincidencia.La longitud de una secuencia es el numerode residuos de aminoacido en la secuencia (por ejemplo, la longitud de la SEC 10 n.D: 1 es 188) .

Como ejemplos de endopeptidasas bacterianas aplicables para uso segun la invencion pueden ser mencionadas tambien la endopeptidasa de Nocardiopsis alba (previamente Nocardiopsis dassonvillei) NRRL 18133 descrita en el documento W088/03947, las endopeptidasas d e Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei 0SM 4 3235, Nocardiopsis alba 0SM 15647, Nocardiopsis sp. 0SM 16424 y la proteasa sintetica 22, descritas las cuatro en el documento W004/111220, la endopeptidasa de Nocardiopsis prasina 0SM 15648 descrita en el documento W004/111222, la endopeptidasa de Nocardiopsis prasina 0SM 15649 descrita en el documento W004/111223, las endopeptidasas de Nocardiopsis prasina (previamente Nocardiopsis alba) 0SM 14010, Nocardiopsis alkaliphila 0SM 44657 y Nocardiopsis lucentensis 0SM 44048, descritas las tres en el documento W005/123911, las endopeptidasas de Brachysporiella gayana CGMCC 0865, Metarhizium anisopliae, Gliocladium sp. CBS 114001, Periconia sp. CBS 114002, Periconia sp. CBS 114000 y Curvularia lunata de CBS 114003, descritas las 6 en W004/072279, y mutantes, variantes o fragmentos de cualquiera de estas que muestren actividad de endopeptidasa.

Una endopeptidasa para uso segun la invencion es una endopeptidasa microbiana, preferiblemente una endopeptidasa bacteriana, indicando el termino bacteriano, que la endopeptidasa se derivada de, o tiene origen en, una bacteria, o es un analogo, un fragmento, una variante, un mutante, o una endopeptidasa sintetica derivada de una bacteria. Se puede producir o expresar en la cepa bacteriana de tipo salvaje original, en otra cepa microbiana, o en una planta; es decir, el termino abarca la expresion de endopeptidasas de tipo salvaje de origen natural, al igual que la expresion en cualquier huesped de endopeptidasas recombinantes, geneticamente modificadas o sinteticas.

En el proceso de la invencion, la endopeptidasa puede ser purificada. El termino "purificada" como se utiliza en este caso abarca preparaciones de proteina enzimatica en las que la preparacion ha sido enriquecida para la proteina enzimatica en cuestion. Tal enriquecimiento podria ser por ejemplo: la eliminacion de las celulas del organismo del cual se produjo una proteina enzimatica extracelular, la eliminacion de material no-proteinico por una precipitacion especifica de proteina o el uso de un procedimiento cromatografico en el que la proteina enzimatica en cuestion se adsorbe de forma selectiva y se eluye de una matriz cromatografica. La endopeptidasa puede haber sido purificada a una extension tal que s olo haya pr esentes cantidades menores de otras proteinas. La e xpresion " otras proteinas" se refiere en particular a otras enzimas. Una endopeptidasa para ser usada en el metodo de la invencion puede ser "sustancialmente pura", es decir, sustancialmente libre de otros componentes del organismo en el que fue producido, que puede ser, bien un microorganismo de origen natural o un microorganismo huesped geneticamente m odificado par a la produccion recombinante de la endopeptidasa.

No obstante, para los usos segun la invencion, la endopeptidasa no necesita tener tal grado de pureza. Puede,... [Seguir leyendo]

1. Metodo para la produccion de un hidrolizado de caseina, comprendiendo:

a) adicion de una endopeptidasa con al menos un 50% de identidad con la SEC 10 n.D: 1 a una co mposicion comprendiendo caseina, e b) incubacion para hidrolizar la caseina.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la endopeptidasa tiene al menos un 60% de identidad con la SEC 10 n.D:

1.

3. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la endopeptidasa tiene al menos un 80% de identidad con la SEC 10 n.D:

1.

4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH optimo de la endopeptidasa esta entre pH 9.5 y pH 10.5.

5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura optima de la endopeptidasa con pH 9 es de al menos 60 º C.

6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la endopeptidasa es de Nocardiopsis.

7. M etodo segun cualquiera de l as reivindicaciones precedentes, en e l q ue la endopeptidasa s e an ade con una concentracion de entre 1 y 1000 mg de proteina enzimatica por kg de caseina.

8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la endopeptidasa se anade con una actividad de entre 0.01 y 50 UA por kg de caseina.

9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composicion comprende desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 25% de caseina.

10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el hidrolizado de caseina tiene un grado de hidrolisis de al menos 2%.

11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas el tratamiento de la composicion de caseina con una o mas enzimas adicionales con actividad de proteasa.

12. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas el tratamiento de la composicion de caseina con una o mas exopeptidasas.

13. Hidrolizado de caseina producido por el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

14. Uso de un hidrolizado de caseina producido segun el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en un producto alimenticio.