Un procedimiento de preparación de una solución para análisis proteómico que tiene una composición cambiada de componentes biológicos en la que la proporción de concentración de albúmina en las proteínas totales es menor de 0,

3 y la proporción de concentración de β2-microglobulina en las proteínas totales es al menos 10 veces más alta que la proporción de concentración en la solución de partida que contiene componentes biológicos, comprendiendo el procedimiento someter la solución que contiene componentes biológicos a tratamiento en al menos dos etapas; en el que las dos etapas se seleccionan entre (1) una etapa de adsorción de una parte o todas las proteínas que tienen un peso molecular igual o superior al de la albúmina; (2) una etapa de retiro de una parte o todas las proteínas que tienen un peso molecular igual o superior al de la albúmina mediante fraccionamiento con un tamiz molecular; y (3) una etapa de concentración de proteínas, en donde se emplea en la etapa (1) o la etapa (2) una membrana de separación de fibra hueca de polisulfona que contiene canales de flujo que tienen una estructura asimétrica que se deriva de polisulfona y poli(vinilpirrolidona) y tiene una proporción de permeación comparativa de β2-microglobulina con respecto a albúmina, definida como

coeficiente de tamizado de β2-microglobulina,

coeficiente de tamizado de albúmina

de al menos 50.

Método de preparación de una solución para análisis proteómico [0001] La invención se refiere a un método y un aparato de preparación de una solución que contiene componentes biológicos, particularmente una solución que contiene componentes biológicos con composición cambiada obtenidos aislando moléculas biológicas, tales como proteínas extraídas de suero humano, orina, o similares. Especialmente, la invención se refiere a un método y un aparato para la preparación de una solución de componentes biológicos con composición cambiada, retirando componentes que inhiben la detección de componentes vestigiales, particularmente retirando proteínas con altos pesos moleculares con el fin de realizar el análisis clínico del proteoma.

[Antecedentes de la técnica]

Recientemente, la investigación sobre el análisis del proteoma (proteómica) ha comenzado a llamar la atención como investigación postgenómica. Dado que es una suposición muy probable que las proteínas, productos génicos, estén vinculadas más directamente con síndromes de enfermedades que los genes, se han generado grandes expectativas en que los descubrimientos y logros de la investigación del análisis del proteoma de la investigación exhaustiva de las proteínas puedan aplicarse ampliamente para el diagnóstico y la atención médica. Además, es altamente posible descubrir muchas proteínas que causan enfermedades y factores relevantes para enfermedades, que no pueden descubrirse mediante el análisis del genoma.

El análisis estructural de alta velocidad se ha hecho posible mediante MS (espectrometría de masas) y técnicamente ha contribuido enormemente al rápido avance del análisis del proteoma y a la aplicación práctica de MALDI-TOF-MS (espectrometría de masas de tiempo de vuelo y desorción/ionización por láser asistida por matriz) ha permitido que el ultramicroanálisis de polipéptidos se realice con un alto rendimiento, y que hace posible identificar incluso proteínas vestigiales que no han sido detectadas convencionalmente y, por consiguiente, se convierte en una potente herramienta para buscar factores relevantes para enfermedades.

El primer objetivo de la aplicación clínica del análisis del proteoma es descubrir proteínas biomarcadoras inducidas o eliminadas por enfermedades. El biomarcador se comporta con respecto a síntomas de enfermedades, de modo que puede ser un marcador para el diagnóstico y también muy posiblemente se convierte en una diana para producir productos farmacéuticos. Es decir, dado que es muy posible que los descubrimientos y logros del análisis del proteoma sean aplicables para descubrir un marcador de diagnóstico y una diana para producir productos farmacéuticos en lugar de un gen especificado, puede decirse que el análisis del proteoma se convierte en una tecnología clave para el diagnóstico y la atención médica en la era postgenómica y, dado que el biomarcador identificado aporta directamente beneficios para los pacientes, es decir, la evaluación de la respuesta a los productos farmacéuticos y expectativas de desarrollo de efectos secundarios, puede decirse que esta técnica desempeña un papel importante para promover la llamada atención médica a medida.

En el caso en el que hay que introducir el análisis del proteoma en la investigación clínica, es necesario analizar de forma rápida y fiable un gran número de muestras y, además, dado que cada muestra clínica es escasa en cantidad y muy valiosa, se requiere realizar una medición de alta resolución, alta sensibilidad y altamente funcional. La espectrometría de masas ha impulsado considerablemente el análisis, y las características de los espectrómetros de masas, es decir, alta sensibilidad y alto rendimiento, han contribuido enormemente al análisis. Sin embargo, aunque las técnicas y aparatos han mejorado rápidamente, la presente situación no está lista aún para realizar de forma sencilla y rápida el análisis del proteoma en un campo clínico.

Una de las causas se atribuye al pretratamiento de muestras clínicas. Es necesario fraccionar y refinar proteínas de una muestra clínica antes del análisis de masas, y el tratamiento sigue tardando varios días, y la operación del pretratamiento es complicada y requiere experiencia y habilidad y esto se convierte en un gran obstáculo para la aplicación clínica. Si el diagnóstico de una enfermedad en todo el cuerpo y el control de síntomas se han hecho posibles con una pequeña cantidad de sangre y fluido corporal, esto es marcadamente útil. Sin embargo, sigue habiendo muchos desafíos que superar, debido a la variación de proteínas contenidas en el plasma sanguíneo.

Se supone que hay 100.000 o más tipos de proteínas humanas y aproximadamente 10.000 tipos de proteínas están contenidos en el suero y la concentración de las proteínas totales en el suero es de aproximadamente 60 a 80 mg/ml. Las proteínas contenidas en un suero humano son albúmina (peso molecular: 66 kDa) , inmunoglobulina (150 a 190 kDa) , transferrina (80 kDa) , haptoglobina (>85 kDa) y lipoproteína (varios 100 de kDa) y todas ellas existen respectivamente en una cantidad que supera 1 mg/ml. Por otro lado, muchas proteínas activas fisiológicas tales como hormonas peptídicas, interleuquina y citoquina eran biomarcadores de síntomas y factores relevantes para enfermedades existen en una cantidad mínima inferior a 1 ng/ml y el contenido no es superior a niveles de nano a picométricos en comparación con los de los componentes de alto contenido con altos pesos moleculares. En términos del tamaño de proteínas, el 70% o menos en todos los tipos de proteínas tiene un peso molecular de

60.000 (60 kDa) o menos y las proteínas biomarcadoras mencionadas anteriormente que existen en una cantidad mínima están casi todas incluidas en este intervalo (referencia al Documento no de Patente Nº 1) . Dado que estas proteínas son excretadas parcialmente a la orina a través de los riñones, no solamente la sangre sino también la orina puede usarse como muestra.

Para realizar el análisis del proteoma mediante investigación serológica general, en primer lugar es esencial retirar componentes de alto peso molecular con un peso molecular de 60.000 o superior, que se convierten en obstáculos para la detección de componentes vestigiales relevantes para causas patógenas, y recuperar proteínas con un peso molecular menor que 15.000 en la medida de lo posible.

Actualmente, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (LC) y electroforesis bidimensional (electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional: 2D-PAGE) se han empleado como medios de separación y retirada de las proteínas de alto peso molecular, sin embargo se requieren de 1 a 2 días solamente para la operación de LC y 2D-PAGE. El tiempo necesario para ellas es muy largo en comparación con el tiempo de análisis, varios minutos, para MALDI-TOF-MS y ESI-MS (espectrometría de masas de ionización por electropulverización) y el notable punto ventajoso de que MS, un medio de análisis, tiene un alto rendimiento no puede exhibirse suficientemente en el análisis clínico del proteoma. Por lo tanto, debe decirse que, en el momento presente, la MS es insuficiente en aplicaciones prácticas con el fin de obtener resultados de análisis en un tiempo lo más corto posible para el diagnóstico y la atención médica en campos de tratamiento médico y se convierte en una causa significativa de dificultad de utilización de MS para las investigaciones clínicas cotidianas.

Por lo tanto, se espera que la rapidez de diagnóstico de las investigaciones clínicas mediante análisis clínico del proteoma pueda mejorar notablemente si el medio de eliminación de una parte de o de todas las proteínas de alto peso molecular de una muestra se acelera. En la práctica, eso puede conseguirse si se hace disponible un método o un aparato de obtención de una solución que contiene componentes biológicos con una composición cambiada de componentes biológicos mientras se deja un grupo de proteínas pretendidas a partir de una pequeña cantidad de una muestra a una alta velocidad, en lugar de LC y 2D-PAGE.

Como productos ya utilizados en la práctica o técnicas descritas para medios de eliminación de una sustancia objeto principal, albúmina, existen un vehículo (comercializado) en el que un ligando de afinidad tal como un colorante azul se inmoviliza, un aparato tubular de centrifugado (comercializado) para fraccionar los componentes de alto peso molecular mediante filtración centrífuga, un método de fraccionamiento mediante principio de electroforesis, un método... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de una solución para análisis proteómico que tiene una composición cambiada de componentes biológicos en la que la proporción de concentración de albúmina en las proteínas totales es menor de 0, 3 y la proporción de concentración de B2-microglobulina en las proteínas totales es al menos 10 veces más alta que la proporción de concentración en la solución de partida que contiene componentes biológicos, comprendiendo el procedimiento someter la solución que contiene componentes biológicos a tratamiento en al menos dos etapas; en el que las dos etapas se seleccionan entre (1) una etapa de adsorción de una parte o todas las proteínas que tienen un peso molecular igual o superior al de la albúmina; (2) una etapa de retiro de una parte o todas las proteínas que tienen un peso molecular igual o superior al de la albúmina mediante fraccionamiento con un tamiz molecular; y (3) una etapa de concentración de proteínas, en donde se emplea en la etapa (1) o la etapa (2) una membrana de separación de fibra hueca de polisulfona que contiene canales de flujo que tienen una estructura asimétrica que se deriva de polisulfona y poli (vinilpirrolidona) y tiene una proporción de permeación comparativa de B2-microglobulina con respecto a albúmina, definida como

coeficiente de tamizado de B2-microglobulina, coeficiente de tamizado de albúmina

de al menos 50.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se usa una membrana de separación que contiene una o más sustancias seleccionadas de celulosa, acetato de celulosa, un policarbonato, una polisulfona, un éster de ácido (poli) metacrílico, un éster de ácido (poli) acrílico, una poliamida, fluoruro de polivinilideno, poliacrilonitrilo, polietileno y polipropileno, en la etapa (3) .

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que se usa un material que fija una o más sustancias seleccionadas de un grupo que consiste en una polietilenimina, una aminometilpiridina, un polifenol, un colorante azul, un ión metálico divalente y un compuesto que contiene grupo alquilo en la superficie, en la etapa (1)

o la etapa (2) .

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que una o más sustancias seleccionadas de un grupo que consiste en un tensioactivo, un emulsionante, un disolvente orgánico, un alcohol, un etilenglicol, un propilenglicol, una polietilenimina, una aminometilpiridina, sulfato de protamina, sulfato de amonio, un polifenol, un colorante azul, una sal caotrópica y un compuesto que contiene un grupo hidrofóbico seleccionado de metilo, bencilo, fenilo, clorometilo, octilo y laurilo, se añade a una solución acuosa en la etapa (1) o la etapa (2) .

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la solución que contiene componentes biológicos contiene una muestra de componentes obtenidos de un ser humano.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la membrana de separación tiene una proporción de permeación comparativa de al menos 70.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la proporción de concentración de albúmina en las proteínas totales es menor de 0, 1.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la membrana tiene una proporción de permeación comparativa de B2-microglobulina con respecto a albúmina no superior a 10.000.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la proporción de concentración de B2-microglobulina en las proteínas totales en la solución que tiene una composición cambiada es al menos 100 veces más alta que la proporción de concentración en la solución que contiene componentes biológicos.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que los componentes biológicos son una solución que contiene proteínas extraídas de sustancias obtenidas de sangre, plasma sanguíneo, sueros, orina, ascitis, saliva, lágrima, líquido cefalorraquídeo, exudado pleural o células.

11. Un procedimiento de análisis de proteínas contenidas en componentes biológicos, que comprende la preparación de una solución que tiene una composición cambiada de los componentes biológicos mediante un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y a continuación el análisis de las proteínas contenidas en la solución.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el medio para analizar proteínas incluye al menos uno seleccionado entre espectrometría de masas, análisis electroforético y cromatografía de líquidos.

13. Un aparato para preparar una solución adecuada para análisis proteómico que tiene una composición cambiada en la que la proporción de concentración de albúmina en las proteínas totales es menor de 0, 3 y la proporción de concentración de B2-microglobulina en las proteínas totales es al menos 10 veces más alta que la proporción de concentración en la solución de partida que contiene componentes biológicos, en el que el aparato comprende al

menos dos tipos de medios conectados mediante una trayectoria de flujo y seleccionados entre (1) medios de adsorción de una parte o todas las proteínas que tienen un peso molecular igual o superior al de la albúmina; (2) medios de retirada de una parte o todas las proteínas que tienen un peso molecular igual o superior al de la albúmina mediante fraccionamiento con un tamiz molecular; y (3) medios de concentración de proteína, y en el que (1) ó (2) comprende una membrana de separación de fibra hueca de polisulfona que contiene canales de flujo que tienen una estructura asimétrica que se deriva de polisulfona y poli (vinilpirrolidona) y tiene una proporción de permeación comparativa de B2-microglobulina con respecto a albúmina de al menos 50.

14. Aparato de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende una trayectoria de salida de flujo de líquido a ser conectada a un cromatógrafo de líquidos, un aparato electroforético o un espectrómetro de masas.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción