METODO PARA SEPARACION Y DETECCION DE PROTOZOARIOS.

Método para separación y detección de protozoarios.

Un método que permite la separación y detección de protozoarios,

con potencial para extenderse a especies de fisiología similar, a través de la ingestión por los mismos de material magnético biocompatible. El método tiene las siguientes etapas: realizar un cultivo de la especie con ferrofluido biocompatible consistente en nanopartículas de magnetita de tamaños en el rango aproximado de 20 < d < 150 nm recubiertas con dextrano, en concentraciones de 10 a 80 mg/ml, separar la población de parásitos que han incorporado efectivamente las partículas magnéticas, a través de centrifugación en gradiente discontinuo de densidades; y detectar la población de parásitos magnetizados a través de un magnetómetro o susceptómetro, que permite medir la imantación del cultivo; y comparar la imanación del cultivo con la del ferrofluido puro como referencia

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200700037.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA..

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: ZARAGOZA.

Inventor/es: IBARRA GARCIA,MANUEL RICARDO, GOYA,GERARDO FABIAN, SILBER,ARIEL MARIANO.

Fecha de Solicitud: 27 de Diciembre de 2006.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 27 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/02 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Separación de microorganismos de sus medios de cultivo.
  • C12Q1/04 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Determinación de la presencia o del tipo de microorganismo; Empleo de medios selectivos para la investigación o análisis de antibióticos o bactericidas; Composiciones para este fin que contienen un indicador químico.
  • C12Q1/24 C12Q 1/00 […] › Métodos de toma de muestra, de inoculación o desarrollo de una muestra; Métodos para aislar físicamente un microorganismo intacto.

Clasificación PCT:

  • B03C1/00 TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B03 SEPARACION DE SOLIDOS POR UTILIZACION DE LIQUIDOS O POR UTILIZACION DE MESAS O CRIBAS DE PISTON NEUMATICO; SEPARACION MAGNETICA O ELECTROSTATICA DE MATERIALES SOLIDOS A PARTIR DE MATERIALES SOLIDOS O DE FLUIDOS; SEPARACION POR CAMPOS ELECTRICOS DE ALTA TENSION.B03C SEPARACION MAGNETICA O ELECTROSTATICA DE MATERIALES SOLIDOS A PARTIR DE MATERIALES SOLIDOS O DE FLUIDOS; SEPARACION POR CAMPOS ELECTRICOS DE ALTA TENSION (filtros que utilizan la electricidad o el magnetismo B01D 35/06; separación de isótopos B01D 59/00; separación en que se combinan los procedimientos magnéticos o electrostáticos con los otros medios de separación de sólidos B03B, B07B; separación de hojas amontonadas B65H 3/00; imanes o bobinas magnéticas en sí H01F). › Separación magnética.
  • C12N1/02 C12N 1/00 […] › Separación de microorganismos de sus medios de cultivo.
  • C12Q1/04 C12Q 1/00 […] › Determinación de la presencia o del tipo de microorganismo; Empleo de medios selectivos para la investigación o análisis de antibióticos o bactericidas; Composiciones para este fin que contienen un indicador químico.
  • C12Q1/24 C12Q 1/00 […] › Métodos de toma de muestra, de inoculación o desarrollo de una muestra; Métodos para aislar físicamente un microorganismo intacto.
  • C12R1/90 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Protozoos.

Fragmento de la descripción:

Método para separación y detección de protozoarios.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es un método que permite la separación y detección de protozoarios a través de la ingestión por los mismos de material magnético biocompatible, con potencial para extenderse a otros organismos unicelulares eucariotas (reino Protista) de fisiología relacionada tales como algas, bacterias, y hongos.

Estado de la técnica

La propagación de diversas enfermedades infecciosas a través de especies de protozoarios en animales y humanos es uno de los principales problemas de la salud pública en diversos países en desarrollo. En un considerable número de estas enfermedades (por ej. Tripanosomiasis Africana o Americana, o Leishmaniasis), no se dispone hasta hoy de vacunas para prevenirlas ni medicamentos eficientes para su tratamiento. Las alternativas terapéuticas actualmente disponibles presentan problemas tales como poca eficiencia terapéutica, efectos colaterales severos y el surgimiento de cepas resistentes [ver referencia SIL05].

La tripanosomiasis que presenta la mayor diversidad de complicaciones clínicas es la americana, siendo caracterizada por una fase inicial (aguda), con una parasitemia evidente, seguida de una fase indeterminada, asintomática, que evoluciona a una fase crónica, con sintomatologías características. Dependiendo de cada fase, los exámenes recomendados para la detección en laboratorio incluyen: observación directa de sangre (frotis y gota gruesa), técnicas de concentración de sangre (Strout, microstrout), hemocultivo e incluso métodos indirectos serológicos (hemaglutinación directa o indirecta, inmunofluorescencia indirecta y ELISA) [ver referencia WHO06]. Estos métodos son complejos y costosos. Por otro lado, métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas Polymerase Chain Reaction en inglés) todavía no forma parte de la rutina laboratorial diagnóstica, por lo tanto hasta ahora ésta técnica sólo está disponible en laboratorios de investigación.

Frente a estas dificultades para establecer exámenes fiables en clínicas y laboratorios, la posibilidad de detección de parásitos a través de técnicas magnéticas conlleva la evidente ventaja de ser un método no invasivo, rápido y de bajo costo.

Los usos previamente reportados de nanopartículas magnéticas en bacterias o unidades biológicas menores están relacionados a la aplicación de gradientes de campo magnético para separación y fijación [GU05,BUC03]. Sin embargo, la presente propuesta esta basada en la inclusión (fagocitosis) de las nanopartículas magnéticas por los protozoarios, y posterior análisis y detección por técnicas magnetométricas estándar.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación de la concentración de parásitos presentes en una muestra de sangre. La técnica propuesta utiliza como elemento básico una suspensión coloidal biocompatible de magnetita o hierro en base acuosa, de concentración variable. El material magnético consiste en una distribución de nanopartículas magnéticas, compuestas de núcleos magnéticos de magnetita (Fe3O4) de <d> = 20 nm y coberturas de polisacáridos (por ej. Dextrano) o péptidos.

Este método permite la separación y detección de protozoarios (ya verificada en dos especies, y con potencial para extenderse a especies de fisiología similar) a través de la ingestión de material magnético biocompatible. La detección de parásitos en concentraciones de 104-105 individuos/ml similares a las concentraciones en sangre.

El método de la invención es potencialmente adaptable a la detección in vivo, dependiendo de la respuesta (fisiología) de cada protozoario en los diferentes estadios de su ciclo de vida.

El proceso de separación propuesto garantiza que la señal magnética está vinculada a los parásitos asociados a parte del material magnético.

La técnica de detección de los parásitos magnetizados posee, respecto a las actuales técnicas de laboratorio, las ventajas de ser rápido (2-10 seg en la detección), de bajo coste (infraestructura usual de un Lab. de análisis) y sencilla implementación (utilización de técnicas de separación por centrifugación en un gradiente discontinuo de densidades comúnmente empleadas).

El proceso consiste en tres etapas principales:

1. Cultivo de la especie con ferrofluido biocompatible consistente en nanopartículas de magnetita de tamaños en el rango aproximado de 20 < d < 150 nm recubiertas con polisacáridos/péptidos, en concentraciones de 10 hasta 80 mg/ml.

2. Separación de la población de parásitos que han incorporado efectivamente las partículas magnéticas, a través de centrifugación en gradiente discontinuo de densidades.

3. Detección de la población de parásitos magnetizados se realiza a través de un magnetómetro o susceptómetro, que permite medir la imantación del cultivo y compararlo con el ferrofluido puro como referencia.

Las etapas del proceso se describirán ahora en detalle en una descripción de experimentos específicos realizados.

Descripción de los experimentos específicos realizados

En diversos experimentos realizados, las etapas del método se llevaron a la práctica de la forma siguiente:

1. Cultivos

Los epimastigotes de T. cruzi cepa CL clon 14 son crecidos en medio LIT suplementado con 10% de SFB, mantenidos en fase exponencial por repique cada 24/48 horas. Se hizo un segundo experimento idéntico al primero, con T cruzi, con diferente proceso de resuspensión, llevando a los mismos resultados.

Dos ferrofluidos (coloides) : #1 (350 nm) y #4 (20 nm). Incubación durante la noche (aprox. 16 hs de incubación 109 células en 4 ml de medio de cultivo).

2. Separación

Usando sacarosa para formar un gradiente discontinuo de densidad, se separa la mezcla de parásitos asociados a partículas de las partículas que sobran (partículas libres). En detalle:

1. Resuspender la muestra agitando.

2. En un tubo Falcon de 15 ml pipetear 2 ml de sacarosa 2 M en PBS (colchón de sacarosa). Sobre este colchón, pipetear el cultivo. Centrifugación (3000 x g) 10 minutos en colchón de Sacarosa 2 M.

Un experimento idéntico, utilizando el protozoário Crithidia deanei mostró comportamiento similar, excepto que no hubo formación de pellet. Se cultivaron en medio de Warren suplementado con 10% SFB.

3. Detección magnética

Los parásitos fueron detectados a través de la observación de la temperatura de bloqueo en las curvas M(T) en modo zero-field-cooling. También fue observada la señal magnética en los ciclos de imanación M(H) a temperatura ambiente.

Para todas las muestras, medimos

a. M(T) a 100 G en modo ZFC para ver el bloqueo de las partículas, y

b. los ciclos M(H) a 10 K y 240 K.

Los protozoos que han fagocitado las partículas magnéticas poseen imanación suficiente para ser atraídos por un imán, con lo que puede implementarse una etapa previa de concentración vía separación magnética, tanto en el tubo de ensayo cuanto en un portaobjetos de microscopio. Se ve a simple vista la aglomeración en la pared del tubo.

Los limites de detección varían según el instrumento utilizado, pero su limite inferior puede estimarse a partir de la sensibilidad de magnetómetros SQUID de uso corriente [ver referencia SQU97]. Estos magnetómetros pueden detectar señales del orden de 10-6 emu, [ver referencia SQU00] lo que correspondería a 106-108 partículas de Fe3O4 con diámetros d = 150 y 20 nm, respectivamente. Para transformar estos valores de 106 - 108 partículas/ml en concentración de protozoarios, debe corregirse por un factor que depende del numero medio de partículas fagocitadas (10 partículas de 150 nm, o 50 partículas de 20 nm por protozoario), lo que implica un limite de detección menor que 105 protozoarios/ml, muy por debajo de las concentraciones usuales en sangre de portadores infectados en el estadio inicial.

Una vez descritas suficientemente las características de la invención, sólo debe añadirse que pueden realizarse modificaciones de detalle siempre que no afecten a las características esenciales de la misma,...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para la separación y detección de protozoarios u otros organismos unicelulares eucariotas (reino Protista) de fisiología relacionada caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- realizar un cultivo de la especie con ferrofluido biocompatible consistente en nanopartículas de magnetita de tamaños en el rango aproximado de 20 < d < 150 nm recubiertas con polisacáridos o péptidos, en concentraciones en el rango de 10-80 mg/ml;
- separar la población de de parásitos que han incorporado efectivamente las partículas magnéticas, a través de centrifugación en gradiente discontinuo de densidades;
- detectar la población de parásitos magnetizados a través de un magnetómetro o susceptómetro, que permite medir la imantación del cultivo; y comparar la imanación del cultivo con la del ferrofluido puro como referencia.

2. Uso del método para la separación y detección de protozoarios de la reivindicación 1 para la diagnosis de enfermedades infecciosas que se propagan en animales y humanos a través de especies de protozoarios u otros organismos unicelulares eucariotas (reino Protista) de fisiología relacionada tales como algas, bacterias, y hongos.


 

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