Método para producir un dipéptido.

Un microorganismo procariótico que sobreexpresa cualquiera de entre ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L, donde dichas ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L tienen actividad de síntesis de dipéptidos y

en las que la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de una célula microbiana hacia el exterior de dicha célula microbiana

(referida a partir de este punto como actividad de transporte de dipéptidos) es superior a la de la cepa original, mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica una proteína con actividad de transporte de dipéptidos,

donde dicha proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se describe en cualquiera de los siguientes apartados [1] a [3]:7

[1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, [2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido entre 1 y 20 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos,

[3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con un 80% o más de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2008/056758.

Solicitante: KYOWA HAKKO BIO CO., LTD.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-6-1, OHTEMACHI, CHIYODA-KU TOKYO 100-8185 JAPON.

Inventor/es: TABATA,KAZUHIKO, HAYASHI,Mikiro, YONETANI,Yoshiyuki, YAGASAKI,MAKOTO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con hasta cuatro aminoácidos en una secuencia... > C07K5/06 (Dipéptidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)

PDF original: ES-2526490_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para producir un dipéptido Campo Técnico La presente invención se refiere a un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que presenta actividad de síntesis de un dipéptido, y en el cual la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de la célula microbiana al exterior de la célula microbiana es mayor que la de la cepa original, y un proceso para producir un dipéptido usando el microorganismo.

Antecedentes de la invención Como proceso para producir un dipéptido donde dos aminoácidos L están unidos mediante un enlace α, se conoce un proceso que utiliza el producto génico ywfE que es una de las sintasas de la bacilisina, un dipéptido antibiótico derivado de un microorganismo que pertenece al género Bacillus (documentos de patentes 1 – 8) .

Como método para mejorar la capacidad productora de una cepa en fermentación de aminoácidos L, se conoce un método que incluye alterar un sistema de eflujo para aminoácidos L en una célula microbiana (documentos de patentes 9 – 14) . Adicionalmente, también se conoce la presencia de un sistema de eflujo para Microcina J25, un antibiótico peptídico (documento no patente 1) .

También en la producción de un dipéptido, se considera que la productividad de dipéptido mejora al potenciar la actividad de un sistema de exportación de dipéptidos, a saber, una proteína que presente actividad para transportar un dipéptido de la célula microbiana hacia el exterior de las células microbianas (desde este punto será referida como actividad de transporte de dipéptidos) . Sin embargo, hasta el momento no se ha descubierto ninguna proteína que tenga actividad de transporte de dipéptidos.

Es sabido que el gen bcr de Escherichia coli es un gen que codifica proteína de membrana que está relacionado con la resistencia a biciclomicina (documento no patente 2) , y el gen norE es un gen que codifica una bomba de eflujo que está relacionada con la resistencia a quinolona (documento no patente 3) . Se ha publicado que el gen emrD es un gen que codifica una proteína transportadora de SDS (documento no patente 4) . Se predice que el gen y deE es un gen que codifica una proteína transportadora de fármaco, pero su actividad no ha sido confirmada (documento no patente 4) . La función del gen yeeO permanece completamente desconocida.

Además, previamente se han descrito métodos para producir L-cisteína en microorganismos en los que el gen bcr podría regularse al alza (Patente de EE.UU. 2005/221453) . Adicionalmente, se ha descrito la sobreexpresión de proteínas transportadoras de fármaco (que incluyen el bcr) en E. coli (Applied and Environmental Microbiology, 72 (7) , 4735-4742 (2006) ) . Finalmente, se han descrito métodos para producir dipéptidos en microorganismos, en particular E. coli, donde la E. coli ha sido transformada con el gen ywfE de Bacillus subtilis (EP 1 616 963) .

Documento de Patente 1: WO 2004/058960 Documento de Patente 2: WO 2005/045006 Documento de Patente 3: WO 2005/052153 Documento de Patente 4: WO 2005/052177 Documento de Patente 5: WO 2005/103260 Documento de Patente 6: WO 2006/001379 Documento de Patente 7: WO 2006/001381 Documento de Patente 8: WO 2006/001382 Documento de Patente 9: WO 97/23597 A2 Documento de Patente 10: US 2003/0113899 A1 Documento de Patente 11: JP-A-2000-116390 Documento de Patente 12: JP-A-2000-189177 Documento de Patente 13: JP-A-2005-287333 Documento de Patente 14: JP-A-2005-237379 Documento no patente 1: J. Bacteriol., 187, 3465-3470 (2005)

Documento no patente 2: Gene, 127, 117-120 (1993)

Documento no patente 3: J. Antimicrob. Chemother., 51, 545-56 (2003)

Documento no patente 4: J. Bacteriol., 183, 5803-5812 (2001)

Descripción de la invención Problemas a resolver con la invención La presente invención tiene el objetivo de proporcionar un microorganismo que produzca de manera eficiente un dipéptido, y un proceso para producir un dipéptido usando el microorganismo.

Medios para resolver los problemas La presente invención se refiere a los siguientes puntos (1) – (6) .

(1) Un microorganismo procariótico que sobreexpresa cualquiera entre ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa y amida hidrolasa de aminoácido L, donde dicha ligasa de aminoácido L, dicha prolina imino peptidasa y dicha amida hidrolasa de aminoácido L presentan actividad de síntesis de dipéptidos y

en el que la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de una célula microbiana al exterior de la célula microbiana (denominada a partir de este punto actividad de transporte de dipéptidos) es mayor que la de la cepa original, mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos,

donde dicha proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se describe en cualquiera de los siguientes puntos [1] a [3]:

[1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada por cualquiera de las SEQ ID Nos: 6 a 10,

[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido de 1 a 20 aminoácidos a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos,

[3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de aminoácidos.

(2) El microorganismo de (1) , que se obtiene transformando la cepa original con un ADN descrito en cualquiera de los siguientes puntos [1] a [3]:

[1] un ADN que codifica una proteína de cualquiera de los puntos [1] a [3] de la reivindicación 1,

[2] un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificadora tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 5,

[3] un ADN que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una región codificadora de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 5 en condiciones severas, y que codifica la proteína que tiene actividad de transporte.

(3) El microorganismo de (1) ó (2) , que pertenece al género Escherichia, Cor y nebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.

(4) Un proceso para producir un dipéptido que comprende:

permitir que un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo de uno cualquiera de los puntos (1) a (3) y un aminoácido, éster de aminoácido o amida de aminoácido, esté presente en un medio acuoso, permitiendo que el dipéptido se forme y se acumule en el medio acuoso, y recuperar el dipéptido del medio acuoso.

(5) Un proceso para producir un dipéptido que comprende:

cultivar el microorganismo de (1) ó (2) y que tiene la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácido diferente a los aminoácidos que constituyen el dipéptido en un medio, permitir que se forme el dipéptido y que se acumule en el medio, y recuperar el dipéptido del cultivo.

(6) El proceso de (4) ó (5) , donde el microorganismo pertenece al género Escherichia, Cor y nebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.

Efecto de la Invención Según la presente invención, potenciando la actividad de una proteína que tiene una actividad de transporte de dipéptidos en una célula microbiana de un microorganismo hacia el exterior de la célula microbiana, el dipéptido puede producirse de forma eficiente usando dicho microorganismo.

Mejor método para llevar a cabo la invención 1. Microorganismo de la presente invención (1) Microorganismo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un microorganismo procariótico que sobreexpresa cualquiera de entre ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L, donde dichas ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L tienen actividad de síntesis de dipéptidos y

en las que la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de una célula microbiana hacia el exterior de dicha célula microbiana (referida a partir de este punto como actividad de transporte de dipéptidos) es superior a la de la cepa original, mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica una proteína con actividad de transporte de dipéptidos,

donde dicha proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se describe en cualquiera de los siguientes apartados [1] a [3]:7

[1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10,

[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido entre 1 y 20 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos,

[3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con un 80% o más de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos.

2. El microorganismo de la reivindicación 1, que se obtiene transformando la cepa original con un ADN descrito en cualquiera de los siguientes apartados [1] a [3]:

[1] un ADN que codifica una proteína de cualquiera de los puntos [1] a [3] de la reivindicación 1,

[2] un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificadora tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5,

[3] un ADN que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una región codificadora de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5 en condiciones severas, y que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos.

3. El microorganismo de la reivindicación 1 ó 2, que pertenece al género Escherichia, Cor y nebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.

4. Un proceso para producir un dipéptido que comprende:

permitir que un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un aminoácido, éster de aminoácido o amida de aminoácido estén presentes en un medio acuoso, dejar que se forme y se acumule el dipéptido en el medio acuoso y recuperar el dipéptido del medio acuoso.

5. Un proceso para producir un dipéptido que comprende:

cultivar el microorganismo de la reivindicación 1 ó 2 y que tiene la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácido de entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido en un medio, permitir que se forme y se acumule el dipéptido en el medio, y recuperar el dipéptido del cultivo.

6. El proceso de la reivindicación 4 ó 5, donde el microorganismo pertenece al género Escherichia, Cor y nebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.