Método para producir teicoplanina altamente pura.

Un método para producir teicoplanina, que comprende:

(a) ultrafiltración de un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina;



(b) la elución con alcohol del filtrado fruto de la ultrafiltración, adsorbido en una resina porosa de adsorción, para producir a partir de la resina porosa de adsorción un líquido purificado en forma tosca, que contiene teicoplanina; en donde la resina porosa de adsorción, utilizada en la elución de la teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción, incluye de 40 a 90% (v/v) de alcohol C1 a C4 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0, o de 40 a 90% (v/v) de cetona C3 a C6 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0; y

(c) el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando un carbón activado para recuperar la teicoplanina altamente pura, en donde el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando el carbón activado incluye la adición directa del carbón activado dentro del líquido del proceso con un pH de 6 a 8 pasando a través de la resina porosa de adsorción, o añadiendo el carbón activado dentro del líquido del proceso diluido con agua.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/KR2005/001089.

Solicitante: DONG KOOK PHARMACEUTICAL CO., LTD..

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 977-8 Daechi-dong Kangnam-ku Seoul 135-281 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: LIM, DAE, SUNG,, RYU,HO-MYEUNG, LEE,IN-KYU, PAENG,HYUN-KI, KIM,Sung-Woo, YOUN,DEOK-JOONG, LEE,KANG-HEE, CHA,KYUNG-HOI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/739 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Lipopolisacáridos.
  • C07K9/00 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos de hasta 20 aminoácidos, que contienen radicales sacáridos y una secuencia totalmente determinada; Sus derivados.
  • C08B37/00 C […] › C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES.C08B POLISACARIDOS; SUS DERIVADOS (polisacáridos que contienen menos de seis radicales sacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos C07H; procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas C12P 19/00; producción de celulosa D21). › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
  • C12P19/28 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › N-glucósidos.
  • C12P19/60 C12P 19/00 […] › con un átomo de oxígeno del radical sacárido unido directamente a un heterociclo que no sea sacárido o a un sistema cíclico condensado que contiene un heterociclo que no sea sacárido, p. ej. cumermicina, novobiocina.
  • C12P21/00 C12P […] › Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).
  • C12P21/02 C12P […] › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • G01N33/487 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › de material biológico líquido.

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Método para producir teicoplanina altamente pura.

Fragmento de la descripción:

Método para producir teicoplanina altamente pura.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con un método para cultivar microorganismos, que es capaz de producir teicoplanina, y de producir teicoplanina altamente pura utilizando un caldo de cultivo. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un método para producir económicamente teicoplanina altamente pura, en el cual se produce teicoplanina en una región estable de pH neutro.

Antecedentes del estado del arte

Actualmente se considera como un problema serio que se propague un microorganismo resistente a los antibióticos debido al abuso de los mismos. Con respecto a esto, la teicoplanina que es un antibiótico glicopeptídico, actúa contra bacterias gram positivas. Particularmente, la teicoplanina, un antibiótico glicopeptídico, que actúa contra bacterias gram positivas, tales como el Estafilococo aureus resistente a la meticilina (MRSA), Estafilococo negativo a la coagulasa, Clostridium y Enterococos, es llamada la última línea de defensa contra las enfermedades infecciosas. La teicoplanina es un complejo de cinco tipos de componentes A2, que tienen diferentes cadenas ramificadas de ácidos grasos, y A3, que tiene una estructura de aglicona en la cual se remueve una fracción de azúcar de N-acil-β-D-glucosamina, incluida la cadena ramificada de ácido graso, de una estructura básica de A2. En esta descripción detallada, se designa a la teicoplanina por medio del complejo A2 de teicoplanina que actúa como un componente efectivo.

Generalmente, se adopta un proceso de síntesis química o un proceso de biosíntesis que utiliza el cultivo del microorganismo para producir antibióticos en cantidades comerciales. Los antibióticos glicopeptídicos tienen una estructura química complicada, en la cual se enlaza el azúcar a un esqueleto peptídico. Por lo tanto, la teicoplanina y los antibióticos glicopeptídicos comercializados como compuestos farmacéuticos son producidos de acuerdo al proceso de biosíntesis denominado proceso de fermentación. En el proceso de biosíntesis, se producen diferentes impurezas, tales como componentes del medio y productos metabólicos, concomitantemente con el antibiótico. Por lo tanto, se requieren una cantidad de procesos de separación y de purificación para la purificación de los antibióticos, que son factores críticos para la producción en forma económica del antibiótico altamente puro.

La teicoplanina, un antibiótico glicopeptídico producido a partir de Actinoplanes teichomyceticus, fue reportado primero en "The Journal of Antibiotics (Vol. 31; 170-177, 1978)". Se han hecho una cantidad de esfuerzos para separar la teicoplanina de un caldo de cultivo del microorganismo y la purificación de la teicoplanina utilizando diferentes procesos con el fin de producir teicoplanina grado farmacéutico. De acuerdo con la revista anterior la con la patente estadounidense No. 4.239.751, se divide un caldo de cultivo en una torta de micelio y en un filtrado. Se extrae la torta de micelio con acetona y se extrae nuevamente el extracto con butanol a un pH ácido. Se extrae el filtrado, liberado de la masa de micelio por filtración, con butanol a pH ácido. Posteriormente, se concentran las capas de butanol por medio de destilación al vacío para formar un precipitado. Se mezclan los precipitados entre sí, y se purifica la mezcla con una columna de Sefadex LH20. Se purifica adicionalmente el eluato de la columna de Sefadex LH20 con una resina de intercambio iónica ácida, tal como IR-120 y Dowex 50, y luego, se precipita la teicoplanina a 4ºC. Sin embargo, la patente estadounidense No. 4.239.751 tiene desventajas ya que la purificación es muy complicada. Además, es difícil porque la columna de Sefadex LH20 es muy costosa para la aplicación en una producción a gran escala. Otra desventaja es que la recuperación y la purificación de la teicoplanina son muy pobres.

La patente coreana No. 367890 describe un proceso para extraer directamente teicoplanina a partir de un caldo de cultivo, en el cual se añade un solvente orgánico miscible en agua, tal como acetona, n-propanol y acetonitrilo sin la separación del micelio. Además, la patente coreana No. 118034 describe un proceso para producir teicoplanina por medio de la adición directa de una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida, tal como Dow XFS-43278.00 y Diaion SK-102, a un caldo de cultivo. Sin embargo, las patentes coreanas Nos. 367890 y 118034 tienen el inconveniente de que, a pesar de tratarse de un proceso de extracción directa de teicoplanina del caldo de cultivo que es más sencillo que en el caso de la patente estadounidense No. 4.239.751, es difícil de emplear en el proceso de producción debido a que la gran cantidad de solvente orgánico que inevitablemente se utiliza para extraer teicoplanina puede ocasionar polución ambiental. Además, es difícil de producir teicoplanina de alta pureza modificando únicamente el proceso de extracción.

Se han llevado a cabo muchos estudios para la purificación de la teicoplanina por medio de procesos cromatográficos en columna utilizando resinas sintéticas, como lo sugieren Heydorn y colaboradores, "J. of Biochem. Vol. 275; 6201-6206, 2000", y como se describe en la patente europea No. 241.758, la patente coreana No. 321304, la publicación de la patente coreana abierta a inspección pública No. 2003-0017067, y la publicación de la patente coreana abierta a inspección pública No. 2003-0034949. Adicionalmente, la patente europea No. 241.758 describe un proceso de purificación de teicoplanina que utiliza una resina de poliamida. Además, la patente coreana No. 184644 describe un proceso de extracción de teicoplanina a partir de micelio con pH alcalino, simplificando así un proceso complicado de extracción de la patente estadounidense No. 4.239.751. En la patente coreana No. 184644, después de la extracción de la teicoplanina, se neutraliza el caldo de cultivo básico, y luego se lo purifica utilizando la resina de poliamida de acuerdo a un procedimiento de la patente europea No. 241.758. Sin embargo, cuando se analizó la teicoplanina purificada por medio de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento), la purificación de la teicoplanina no fue superior al 85% y la decoloración fue pobre. Por lo tanto, se puede observar que se requiere llevar a cabo un proceso adicional de purificación con el fin de producir teicoplanina altamente pura. Con el propósito de estudiar una ruta de biosíntesis de teicoplanina, Heydom y colaboradores han separado y purificado teicoplanina de acuerdo a un proceso cromatográfico utilizando una resina de intercambio iónico (Amberlita IRA958) y una resina hidrófoba de adsorción (Diaion HP2MGL). Sin embargo, este método sugerido por Heydom y colaboradores es desventajoso ya que hay que añadir continuamente ácido acético a la solución básica pasando a través de la resina para neutralizarlo y evitar una epimerización. Adicionalmente, cuando se analiza la pureza de la teicoplanina por medio de HPLC después de desalinizar, concentrar y liofilizar la solución purificada para producir teicoplanina en polvo, la pureza es apenas del 50 al 60% (p/p). Por lo tanto, no es deseable utilizar la teicoplanina en polvo así producida como ingrediente farmacéutico.

Mientras tanto, se han utilizado frecuentemente resinas porosas de adsorción para purificar antibióticos glicopeptídicos, incluida teicoplanina. La patente coreana No. 321304 describe en detalle un proceso para purificar teicoplanina, que incluye una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba utilizando una resina neutra de adsorción y una etapa de cromatografía de afinidad inmovilizada de lecitina. En ese momento, se selecciona la resina de adsorción neutra del grupo que consiste de XAD 16, HP 20, gel de sílice y carbón activado. En esta patente, se purifica directamente un caldo de cultivo filtrado por medio de cromatografía de adsorción hidrófoba utilizando HP-20 y similares, y así, es conveniente llevar a cabo el proceso. Sin embargo, en caso de que el caldo de cultivo filtrado extraído de una solución básica se adsorba en una resina, tal como HP 20, de acuerdo con el proceso de la patente coreana No. 321304, se pierde una gran cantidad de teicoplanina en una etapa de adsorción, y la pureza de la teicoplanina eluida por medio de un gradiente de concentración de metanol es muy baja. Además, es necesario remover el metanol con el propósito de aplicar la solución a una resina inmovilizada de lecitina. Además, no es deseable la aplicación en una producción a gran escala debido al costo de las resinas inmovilizadas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir teicoplanina, que comprende:

(a) ultrafiltración de un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina;
(b) la elución con alcohol del filtrado fruto de la ultrafiltración, adsorbido en una resina porosa de adsorción, para producir a partir de la resina porosa de adsorción un líquido purificado en forma tosca, que contiene teicoplanina; en donde la resina porosa de adsorción, utilizada en la elución de la teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción, incluye de 40 a 90% (v/v) de alcohol C1 a C4 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0, o de 40 a 90% (v/v) de cetona C3 a C6 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0; y
(c) el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando un carbón activado para recuperar la teicoplanina altamente pura, en donde el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando el carbón activado incluye la adición directa del carbón activado dentro del líquido del proceso con un pH de 6 a 8 pasando a través de la resina porosa de adsorción, o añadiendo el carbón activado dentro del líquido del proceso diluido con agua.

2. El método como el expuesto en la reivindicación 1, que comprende además la ultrafiltración del líquido tratado con el carbón activado después de la etapa (c).

3. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la cepa de Actinoplanes teichomyceticus incluye a la cepa DKB 53 de Actinoplanes teichomyceticus.

4. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el agente de elución, utilizado en la elución de la teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción, incluye una sal neutra.

5. El método como el expuesto en la reivindicación 4, en donde una sal neutra incluye una sal sódica o una sal de potasio de 0,05 a 0,5 M.

6. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la resina porosa de adsorción tiene un radio de poro de 20 a 300 Å, y es al menos una seleccionada del grupo que consiste de DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX OPTIPORE L323, DOWEX OPTIPORE SD-2, DIAION HP20, DIAION HP2MG, DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP 850, SEPABEADS SP 700, SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE XAD4, AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T.

7. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se añade el carbón activado en el líquido purificado en forma tosca en una proporción de 0,2 a 5 veces más en peso que de teicoplanina para adsorber al líquido purificado en forma tosca entre 10 y 40ºC en el lapso de 12 horas.

8. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se añade el carbón activado en el líquido purificado en forma tosca en una proporción de 0,5 a 3 veces más en peso que de teicoplanina para adsorber al líquido purificado en forma tosca entre 18 y 36ºC en el lapso de 0,5 a 3 horas.

9. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el carbón activado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste de AQUA NUCHAR, NUCHAR SA, NUCHAR SA-20, NUCHAR SA-30, NUCHAR SN, NUCHAR SN-20, NORIT A SUPRA EUR, NORIT B SUPRA EUR, NORIT C EXTRA USP, NORIT CN 1, NORIT CN 3, DARCO G 60, DARCO KB, DARCO KB-B, NORIT E SUPRA USA, NORIT GBG, NORIT PN2, NORIT ROX 0.8, NORIT SX 1, NORIT SX 1G, NORIT SX 2, NORIT SX PLUS, NORIT SX SUPRA E 153, NORIT SX ULTRA, CAL 12X40, y GW 12X40.

10. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando el carbón activado comprende la filtración del líquido purificado en forma tosca para remover el carbón activado del líquido purificado en forma tosca, la adsorción del líquido filtrado dentro de la resina porosa de adsorción, lavando la resina porosa de adsorción usando agua, y eluyendo la teicoplanina utilizando de 40 a 90% (v/v) de solvente orgánico C1 a C4 miscible en agua.

11. El método como el expuesto en la reivindicación 10, en donde la resina porosa de adsorción tiene un radio de poro de 20 a 300 Å, y es al menos una seleccionada del grupo que consiste de DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX OPTIPORE L323, DOWEX OPTIPORE SD-2, DIAION HP20, DIAION HP2MG, DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP 850, SEPABEADS SP 700, SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE XAD4, AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T.

12. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la membrana de ultrafiltración, utilizada cuando se ultrafiltra el caldo de cultivo o el líquido purificado en forma tosca, tiene un corte de peso molecular de 3.000 a 100.000 Da.

13. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se lleva a cabo la ultrafiltración a una temperatura de 8 a 30ºC, una presión de entrada de 0 a 4 bares y una presión de retentado de 0 a 3,5 bares.

14. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se lleva cabo la ultrafiltración a una temperatura de 12 a 18ºC, una presión de entrada de 0 a 4 bares y una presión de retentado de 0 a 3,5 bares.

15. El método como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se elabora la membrana de ultrafiltración de poliéter sulfona o celulosa regenerada, y es al menos una seleccionada del grupo que consiste de Biomax, Ultracel, PT y PL de módulo Prostak, Helicon, Sartocon, Ultrasart, OMEGA, ALPHA, REGEN, SUPOR, Filmtec, y Kvick.


 

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