Método para preparar polipéptidos de insulina madura.

Método para hacer insulina humana madura o un derivado análogo por cultivo de una célula fúngica que comprende una secuencia de ADN que codifica un precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana con la secuencia

B- X1 - X X2- Z- X3 -X4 - A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo

, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de 2 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes y que son seleccionados del grupo que consiste en Phe, Leu, Ile, Val y Ala, y que facilitarán una escisión más eficaz de Kex2 en la célula fúngica, X2 es un sitio de escisión Kex2, Z es una secuencia peptídica con residuos de aminoácidos de 1 a o un enlace peptídico, X3 es un sitio de escisión Kex2 y X4 es un enlace peptídico.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/060209.

Solicitante: NOVO NORDISK A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Novo Allé 2880 Bagsvaerd DINAMARCA.

Inventor/es: NØRGAARD,PER, SLOTH ANDERSEN,ASSER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/62 (Insulinas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)

PDF original: ES-2464282_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para preparar polipéptidos de insulina madura

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para hacer insulina madura o análogos de insulina en la levadura.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La insulina es una hormona polipeptídica producida en las células beta de los islotes de Langerhans. La molécula de insulina activa es una molécula bicatenaria que consiste en una cadena A y una B conectada por dos puentes de disulfuro. La insulina se sintetiza como una proinsulina de molécula precursora con la estructura B-C-A donde la cadena de péptido C conecta el residuo de aminoácido C-terminal en la cadena B con el residuo de aminoácido N-terminal en la cadena A. La insulina bicatenaria madura se forma por la escisión in vivo del péptido C al par de los residuos de aminoácidos básicos situado en la conjunción con la cadena A y B. Las cadenas A y B son sujetadas por dos puentes de disulfuro entre los residuos A7 y B7 y el A20 y B19 Cys, respectivamente. Además, la molécula de insulina biológicamente activa tiene un puente de disulfuro interno entre los residuos Cys en la posición A6 y A11

Después del desarrollo de ADN recombinante numerosos métodos de tecnología han sido descritos para producir insulina y precursores de los mismos en células huésped genéticamente modificadas. Como E.coli no tiene la maquinaria celular para el pliegue del polipéptido expresado y establecen el puente de disulfuro que conecta la cadena A y B en la insulina madura esta estrategia incluye unos pasos de procesamiento in vitro tal como establecimiento in vitro de los puentes de disulfuro durante el plegado y la posterior escisión del péptido C.

A diferencia de E.coli eucariotas contienen la maquinaria necesaria para el pliegue y el establecimiento de los puentes de disulfuro y así parecerán ser buenos candidatos para la producción de insulina madura en organismos genéticamente modificados. Numerosos procesos de levadura han sido desarrollados para producir insulina. En la mayor parte de estos procesos un precursor de insulina con el péptido natural C o con un péptido C modificado se expresan y se secretan de la célula de levadura. WO 9535384 describe tales métodos. Las moléculas precursoras pueden comprender una extensión de N-terminal de la cadena B de insulina. El péptido C modificado y la posible extensión del N-terminal del péptido B son diseñados para no ser escindidos en la célula de levadura y así los precursores se segregan como péptidos monocatenarios donde las cadenas A y B se conectan todavía por el péptido C modificado pero con puentes de disulfuro correctamente situados. La insulina madura o el producto análogo de insulina es luego obtenido en un número de pasos enzimáticos posteriores in vitro por escisión del péptido C y posiblemente la extensión del N-terminal. Estos pasos enzimáticos son de larga duración, frecuentemente costosos e introducen impurezas adicionales que posteriormente se deben quitar en otros pasos de proceso secuencia abajo como pasos de cromatografía costosa y similares.

Thim et al, Proc Natl. Acad. Sci. USA, volume 83, 6766-6770 y Thim et al, en FEBS Letters, volume 212, number 2, 307-312 revelan expresión de la proinsulina humana y varios precursores de insulina con ciertos péptidos C modificados. WO 97/03089 divulga la expresión de precursores de insulina con la fórmula BZA donde B y A son las cadenas de péptido A y B de insulina humana que están enlazadas por al menos un enlace de disulfuro y Z es un polipéptido que comprende al menos un sitio de escisión proteolítica. US 6337194 describe la expresión en la levadura de un precursor de insulina humana que comprende una cadena B, un primer sitio de escisión Kex2, un epítopo 9E10, un segundo sitio de escisión Kex2 y una cadena A. No obstante, los precursores de insulina descritos sólo dan lugar a cantidades mínimas de insulina madura secretada en el medio de cultivo.

Un proceso para hacer la insulina madura en las células de animal genéticamente modificadas que no son naturalmente capaces de formar gránulos secretores está descrito en la Patente EE.UU. nº 6, 348, 327.

El propósito de la presente invención es desarrollar una cepa fúngica capaz de producir insulina madura completamente procesada o análogos de insulina en altos rendimientos de modo que son evitados pasos de proceso de purificación finales costosos y de larga duración.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto la presente invención se refiere a un método para hacer insulina humana madura o un derivado análogo por cultivo de una célula fúngica que comprende una secuencia de ADN que codifica un precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana con la secuencia

B-X1 – X2 - Z- X3 - X4 - A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de 2 residuos de aminoácidos que pueden ser iguales o diferentes y que son seleccionadas del grupo que consiste en Phe, Leu, Ile, Val y Ala, y que facilitarán una escisión de Kex2 más eficaz en la célula fúngica, X2 es un sitio de escisión Kex2, Z es una secuencia peptídica con de 1 a aproximadamente 35 residuos de aminoácidos o un enlace peptídico, X3 es un sitio de escisión Kex2 y X4 es un enlace peptídico.

En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana con la secuencia

B- X1 - X2- Z- X3 - X4 - A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de 2 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes y que son seleccionados del grupo consistiendo en Phe, Leu, Ile, Val y Ala, y que facilitarán una escisión de Kex2 más eficaz en la célula fúngica, X2 es un sitio de escisión Kex2, Z es una secuencia peptídica con 1 a 35 residuos de aminoácidos o un enlace peptídico, X3 es un sitio de escisión Kex2 y X4 es un enlace peptídico.

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica el precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana con la secuencia

B- X1 X2 - Z- X3 - X4 - A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de 2 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes y que son seleccionados del grupo consistiendo en Phe, Leu, Ile, Val y Ala, y que facilitarán una escisión de Kex2 más eficaz en la célula fúngica, X2 es un sitio de escisión Kex2, Z es una secuencia peptídica con 1 a 35 residuos de aminoácidos o un enlace peptídico, X3 es un sitio de escisión Kex2 y X4 es un enlace peptídico.

En otra forma de realización del residuo de aminoácido el terminal-N de X1 es Leu. En una forma de realización X1 la cadena B se escinde mediante una carboxipeptidasa dando insulina humana madura o un derivado análogo. En una forma de realización la escisión de X1 de la cadena B es mediante una actividad de carboxipeptidasa bien en la célula fúngica o en el medio de cultivo. Así una forma de realización de la invención es un método para hacer insulina humana madura o un derivado análogo por 1) cultivo de una célula fúngica que comprende una secuencia de ADN que codifica un precursor para insulina humana o un análogo de insulina humana con la secuencia

B- X1 - X2 - Z- X3 - X4 - A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para hacer insulina humana madura o un derivado análogo por cultivo de una célula fúngica que comprende una secuencia de ADN que codifica un precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana con la 5 secuencia B- X1 - X X2- Z- X3 -X4 – A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de 2 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes y que son seleccionados del grupo que consiste en Phe, Leu, Ile, Val y Ala, y que facilitarán una escisión más eficaz de Kex2 en la célula fúngica, X2 es un sitio de escisión Kex2, Z es una secuencia peptídica con residuos de aminoácidos de 1 a 35 o un enlace peptídico, X3 es un sitio de escisión Kex2 y X4 es un enlace peptídico.

2. Método según la reivindicación 1, donde el residuo de aminoácido N-terminal de X1 es Leu.

3. Método según la reivindicación 1, donde Z tiene de 1 a 5 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes.

4. Método según la reivindicación 1, donde Z tiene de 3-5 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde X1 es posteriormente escindido de la cadena B mediante una carboxipeptidasa dando insulina humana madura o un derivado análogo. 25

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, donde la carboxipeptidasa se añade al medio de cultivo.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la célula fúngica es una célula de levadura.

8. Precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana con la secuencia B- X1 - X2 - Z- X3 - X4 - A

donde B es la cadena B de insulina humana o un derivado análogo, A es la cadena A de insulina humana o un derivado análogo, X1 es una secuencia peptídica de 2 residuos de aminoácidos que pueden ser los mismos o diferentes y que son seleccionados del grupo que consiste en Phe, Leu, Ile, Val y Ala, y que facilitarán una escisión de Kex2 más eficaz en la célula fúngica, X2 es un sitio de escisión Kex2, Z es una secuencia peptídica con residuos de aminoácidos de 1 a 35 o un enlace peptídico, X3 es un sitio de escisión Kex2 y X4 es un enlace peptídico.

9. Secuencia de ADN que codifica el precursor para la insulina humana o un análogo de insulina humana según la reivindicación 8.