Método para mejorar la actividad enzimática.

Método de selección para mejorar la actividad enzimática en un sustrato insoluble,

donde el método comprende:

(a) proveer una pluralidad de polinucleótidos que codifican variantes de una o más enzimas que actúan en unsustrato insoluble, donde la pluralidad de los polinucleótidos se enlaza a una pluralidad de fases sólidas y elenlazador o las fases sólidas comprenden un sustrato para una o más enzimas;

(b) suspender las fases sólidas enlazadas al polinucleótido en una fase acuosa que comprende componentes para latranscripción/traducción in vitro;

(c) formar una emulsión de agua en aceite, donde las fases sólidas enlazadas de polinucleótido estáncompartimentadas en gotitas acuosas en una fase continua de aceite;

(d) realizar transcripción/traducción in vitro para expresar variantes enzimáticas dentro de gotitas acuosas de laemulsión; y

(e) separar la fase acuosa de la fases sólida y de aceite para la recuperación de polinucleótidos que han sidoliberados de las fases sólidas.

Método para mejorar la actividad enzimática Campo de la invención [0001] La presente invención está dentro del campo técnico del diseño y selección de ingeniería de proteínas. Más particularmente, la presente invención se refiere a la mejora enzimática mediante evolución dirigida.

Antecedentes de la invención [0002] La biomasa celulósica es el recurso natural renovable más abundante. Habiendo generado la biosfera un valor de mil millones de toneladas/año, la biomasa celulósica posee el potencial para reemplazar la demanda mundial y disminuir los combustibles fósiles. No obstante, según Zhang, Y. H. P. "Uno de los retos tecnológicos más importantes y difíciles es obtener la resistencia de los materiales lignocelulósicos naturales que deben ser enzimáticamente hidrolizados para producir azúcares fermentables". Véase, Zhang, Y. H. P., et al., "Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies". Biotechnol. Adv., 2006, 24: 452-481.

La celulosa es un polisacárido que consta de 100 a 20.000 unidades de glucosa con enlace -1-4. Las celulasas, el tipo de enzimas que hidrolizan la celulosa, han atraído un gran interés por su capacidad para degradar la biomasa celulósica a glucosa para la producción de biocombustible. Tres subclases de celulasa (endoglucanasa, exoglucanasa, !-glucosidasa) trabajan sinergísticamente para hidrolizar la celulosa. Las endoglucanasas hidrolizan enlaces glucosídicos !-1-4 intramoleculares a material celulósico insoluble para producir nuevos extremos de cadena. Las exoglucanasas hidrolizan progresivamente los extremos de cadena que liberan pequeños productos oligosacáridos hidrosolubles. Los productos solubles son hidrolizados finalmente mediante !-glucosidasa a glucosa (Schulein, M., "Protein engineering of cellulases". Biochim. Biophys. Acta-Protein Struct. Molec. Enzym., 2000, 1543 (2) : 239-252) .

Resumen de la invención [0004] La invención incluye un sistema para mejorar la actividad enzimática con respecto a un sustrato sólido. En un aspecto, la invención incluye un método de selección para mejorar la actividad de celulasa mediante la compartimentación in vitro en la que una micropartícula celulósica funciona como el sustrato de sólido previsto y como una estructura para la selección negativa. En otro aspecto, la micropartícula puede estar compuesta por lignina u otro sustrato insoluble.

Varias aplicaciones de la invención incluyen un sistema para generar una biblioteca de polinucleótidos. La biblioteca codifica variantes enzimáticas con actividad diferente con respecto al sustrato sólido previsto. El sistema además incluye medios de enlace de copias individuales o clonales de variantes genéticas individuales a una micropartícula compuesta por el sustrato sólido previsto. El sistema también incluye medios para compartimentar micropartículas individuales con genes enlazados en una emulsión que contiene una reacción de transcripción/traducción in vitro. Adicionalmente, el sistema incluye medios para la expresión de cada variante genética enlazada para producir enzimas en cada compartimento de emulsión con una actividad diferente con respecto a la micropartícula. Las micropartículas dentro de compartimentos de emulsión que contienen variantes enzimáticas altamente activas son degradadas, liberando así la variante genética de micropartículas enlazadas. Además, el sistema incluye medios para la rotura de los compartimentos de emulsión y la recuperación selectiva de las variantes genéticas liberadas que codifican enzimas con actividad enzimática mejorada en relación al sustrato de micropartícula. Además, la mejora de la actividad enzimática se puede conseguir generando una nueva biblioteca de polinucleótidos derivada de las variantes genéticas recuperadas y repitiendo los pasos anteriores.

Otras aplicaciones de la invención pueden incluir el uso de un enlazador divisible entre la variante genética y una micropartícula portadora no reactiva. El enlazador puede estar compuesto, por ejemplo, de celulosa, hemicelulosa o lignina. Dentro de compartimentos de emulsión que contienen variantes enzimáticas altamente activas, el enlazador es degradado, liberando así la variante genética enlazada de la micropartícula portadora.

La invención puede incluir una o varias de las siguientes ventajas. La invención utiliza un nuevo método basado en la CIV, modo de selección para optimizar la actividad enzimática de celulasas en los sustratos de celulosa insoluble, y es extensible para optimizar la actividad enzimática en cualquier sustrato insoluble. La selección enzimática se realiza en un material celulósico natural insoluble. Por lo tanto, la actividad enzimática está confeccionada al sustrato real de interés comercial, no un sustrato fluorogénico o soluble de sustitución. Se puede evaluar a poblaciones de 1010 -1012 variantes genéticas, una gran mejora en los métodos basados en su selección que están normalmente limitados a 10.000 variantes. La selección enzimática se realiza completamente in vitro, eliminando los antecedentes genómicos y metabólicos del organismo que conducen a una optimización inespecífica.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención se presentarán con más detalle en la siguiente especificación de la invención y las figuras anexas que ilustran, a modo de ejemplo, los principios de la invención.

Breve descripción de los dibujos [0009] La invención se puede entender haciendo referencia a la descripción siguiente conjuntamente con los dibujos anexos que ilustran formas de realización específicas de la presente invención.

La figura 1 es una representación esquemática de los pasos del proceso implicados en la evolución dirigida mediante compartimentación in vitro (CIV) .

La figura 2 es una representación esquemática de los pasos del proceso implicados en la selección enzimática conforme a la presente invención.

La figura 3 muestra una secuencia 1, que es la secuencia de ADN del gen endoglucanasa egll de Trichoderma reesei (base de datos EMBL #M15665) .

La figura 4 muestra una secuencia 2, que es la secuencia de ADN del gen ligninasa LiP H8 de Phanerochaete chr y sosporium (base de datos EMBL #Y00262) .

Descripción detallada Definiciones [0014] Los términos usados en las reivindicaciones y la especificación son definidos como se expone a continuación a menos que se especifique de otra manera.

El término "polinucleótido" se refiere a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido, y a menos que esté limitado de otro modo, incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. El término "polinucleótido" se refiere a cualquier forma de ADN o ARN, incluyendo, por ejemplo, ADN genómico; el ADN complementario (ADNc) , que es una representación de ADN del ARN mensajero (ARNm) , normalmente se obtiene por transcripción inversa del ARNm o amplificación; las moléculas de ADN son producidas sintéticamente o por amplificación; y ARNm. El término "polinucleótido" abarca moléculas de ácido nucleico bicatenario, así como moléculas monocatenarias. En los polinucleótidos bicatenarios, no es necesario que las hebras de polinucleótidos sean coextensivas (es decir, no es necesario que un polinucleótido bicatenario sea bicatenario a lo largo de toda la longitud de ambas hebras) .

Se dice que los polinucleótidos son "diferentes" si difieren en la estructura, por ejemplo, secuencia de nucleótidos.

Como se utiliza en este caso, el término "sustrato" se refiere generalmente a un sustrato para una enzima; es decir, el material sobre el que actúa una enzima para producir un producto de reacción.

Un "sustrato insoluble", como se utiliza en este caso, se refiere a un sustrato enzimático que no es soluble en agua a 37 °C.

Como se utiliza en este caso, una "fase sólida" se refiere a cualquier material que es un sólido cuando se emplea en los métodos de selección de la invención. La fase sólida es el material al que se enlazan los polinucleótidos para llevar a cabo estos métodos de selección.

El término "enlazador", como se utiliza en este caso, se refiere a cualquier fracción que fija un polinucleótido a una fase sólida.

Los términos "aminoácido" o "residuo de aminoácido" incluyen L-aminoácidos o residuos de origen natural, a menos que se indique específicamente de otra manera. Los términos "aminoácido" y "residuo de aminoácido" también incluyen D-aminoácidos así como aminoácidos químicamente modificados, tales como análogos de aminoácidos, aminoácidos de origen natural que no se incorporan normalmente a las proteínas, y... [Seguir leyendo]

1. Método de selección para mejorar la actividad enzimática en un sustrato insoluble, donde el método comprende:

(a) proveer una pluralidad de polinucleótidos que codifican variantes de una o más enzimas que actúan en un sustrato insoluble, donde la pluralidad de los polinucleótidos se enlaza a una pluralidad de fases sólidas y el enlazador o las fases sólidas comprenden un sustrato para una o más enzimas;

(b) suspender las fases sólidas enlazadas al polinucleótido en una fase acuosa que comprende componentes para la transcripción/traducción in vitro;

(c) formar una emulsión de agua en aceite, donde las fases sólidas enlazadas de polinucleótido están compartimentadas en gotitas acuosas en una fase continua de aceite;

(d) realizar transcripción/traducción in vitro para expresar variantes enzimáticas dentro de gotitas acuosas de la emulsión; y

(e) separar la fase acuosa de la fases sólida y de aceite para la recuperación de polinucleótidos que han sido 15 liberados de las fases sólidas.

2. Método según la reivindicación 1, donde la pluralidad de polinucleótidos comprende al menos 106 polinucleótidos diferentes.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde cada fase sólida enlazada de polinucleótido comprende de 1 a 6 polinucleótidos diferentes, cada uno de los cuales está presente en una o más copias.

4. Método según la reivindicación 3, donde dichos no más de 6 polinucleótidos diferentes codifican de 2 a 6 tipos diferentes de enzimas. 25

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las fases sólidas comprenden microesferas o partículas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la emulsión de agua en aceite se forma bajo

condiciones donde al menos aproximadamente el 20% de gotitas acuosas comprende 1 o menos de 1 fase sólida enlazada al polinucleótido.

7. Método según la reivindicación 6, donde cada fase sólida enlazada al polinucleótido comprende de 1 a 6

polinucleótidos, cada uno de los cuales está presente en una o más copias, por lo cual se expresan respectivamente de 35 1 a 6 variantes enzimáticas por gotita acuosa que contiene una fase sólida enlazada al polinucleótido.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la emulsión comprende al menos aproximadamente 109 gotitas acuosas/ml de emulsión.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase acuosa es separada del sólido y las fases de aceite por sedimentación utilizando un centrifugador.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los polinucleótidos recuperados se amplifican y

enlazan a una pluralidad de fases sólidas, donde el enlazador o las fases sólidas comprenden un sustrato para una o 45 más enzimas, y se repiten los pasos (b) - (e) definidos en la reivindicación 1.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde los polinucleótidos recuperados se mutagenizan y luego se enlazan a una pluralidad de fases sólidas, donde el enlazador o las fases sólidas comprenden un sustrato para una o más enzimas, y se repiten los pasos (b) - (e) definidos en la reivindicación 1.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde uno o más de los polinucleótidos recuperados son traducidos in vitro para producir una o más variantes enzimáticas.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde uno o más de los polinucleótidos recuperados son 55 clonados en un vector.

14. Método según la reivindicación 13, donde el vector comprende un vector de expresión, y el método adicionalmente comprende:

a) expresión de uno o más de los polinucleótidos recuperados para producir una o más variantes enzimáticas; b) recuperación de una o más variantes enzimáticas del cultivo; y c) contacto de una o más variantes enzimáticas con un sustrato insoluble.

15. Método según la reivindicación 14, donde el sustrato insoluble comprende biomasa. 65