MÉTODO PARA MEDIR LA ACTIVACIÓN DE LEUCOCITOS.

A continuación se describe, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la medición de la activación de los trombocitos o plaquetas de la sangre, y en particular dicha medición realizada mediante la determinación del denominado componente medio de trombocitos. Existen múltiples estudios que sugieren que la medición de los indicadores de activación de los trombocitos podría aportar ventajas en la evaluación clínica de pacientes con riesgo de trombosis y otras enfermedades (Macey, M.G., Carty, E., Webb, l., Chapman, E.S.,Zelmanovic D.,Okrongly D., Rampton D.S., Newland, A.C., (1999), Uso del componente medio de trombocitos para medir la activación de los trombocitos en el sistema de hematología ADVIA 120 (sistema de analizador hematológico automatizado) Citometría, 38, 250-255; Mody, M., Lazarus, A.H.,Semple,J.W., Freedman, J., (1999), Requisitos pre-analíticos para la evaluación citométrica de flujo de la activación de trombocitos: elección de anticoagulante. Medicina de Transfusión 9, 147-154. El componente medio de trombocitos (en adelante MPC) es un parámetro que se puede determinar por analizadores hematológicos estándar de laboratorio, tal como el comúnmente utilizado Sistema Hematológico ADVIA ® 120, fabricado por Bayer AG. El MPC es una medición del índice de refracción medio de los trombocitos, y su valor como una medición de la activación de los trombocitos ha sido sugerido anteriormente en la comunicación de Macey y colaboradores a la que se ha hecho referencia anteriormente. La estimulación in Vitro de trombocitos normales en sangre completa por trombina bovina resultó en una activación que condujo a un aumento de la expresión de trombocitos CD62P (P- selectina) (una medición de activación) y una disminución concomitante en MPC. Esta respuesta dependía de la dosis y del tiempo. El sistema hematológico ADVIA 120 tiene un banco óptico de láser que consiste en un diodo de láser, una célula de flujo y conjuntos detectores. Se usa un diodo de láser para producir luz monocromática enfocada sobre la célula de flujo. Según la teoría de Mie sobre dispersión de la luz, la intensidad de la luz monocromática dispersa en un ángulo particular por una esfera homogénea uniforme depende solamente de su volumen y de la diferencia de índices de refracción (en adelante RI) medio entre la esfera y el medio en que está suspendida. Esto proporciona una ecuación para la luz dispersa monocromática dentro de intervalos angulares determinados que es una función solamente de dos incógnitas, el volumen y el RI. La medición de la dispersión de la luz en dos intervalos angulares diferentes apropiados proporciona dos ecuaciones con dos incógnitas que se pueden resolver numéricamente. Esta es la base de las mediciones de eritrocitos y trombocitos del Sistema Hematológico ADVIA 120 (Tycko, D.H., Metzz, M. H., Epstein, E.A., Gribaum, A., (1985), Medición citométrica de flujo por dispersión de la luz del volumen de eritrocitos y concentración de hemoglobina. Applied Optics, 24, 1355-1360; Zelmanovic, D., Colella, G.M., Heheriington, E.J., Chapman, S.E., Paseltiner, L. (1998), Método y dispositivo automatizados para identificar y cuantificar trombocitos y para determinar el estado de activación de trombocitos usando muestras de sangre completa. US-A- Kunicka, J.E., Fischer, G., Murphy, J., y Zelmanovic, D., Cuenta mejorada de trombocitos usando dispersión bidimensional de luz de láser. American Journal of Clinical Pathology 114, 283-289). El ADVIA 120 determina el volumen y el RI de trombocitos en una base de célula por célula. Los trombocitos interceptan un rayo incidente de luz de láser monocromática de 675 ± 10 nm emitida por un fotodiodo cuando pasan a través de una célula de flujo óptica. El sistema mide la intensidad de la luz dispersa en los intervalos de 2-3 grados y de 5-15 grados. El par de valores de intensidad por luz dispersa se transforma en valores de volumen de partículas y del RI por referencia a una tabla de consulta basada en la teoría de la dispersión de MIE para partículas esféricas homogéneas. El valor del RI de los trombocitos se convierte en la concentración de componente medio de trombocitos (MPC) mediante la sustracción del índice de refracción del agua (1,333) del RI, y dividiendo la diferencia por el incremento medio de índice de refracción (0,018 dL/g) (Zelmanovic y colaboradores, 1988). Esta constante se obtiene a partir de los incrementos medios ponderados de índices de refracción para los componentes principales de los trombocitos, a saber, proteínas, lípidos, e hidratos de carbono (Armstrong, S.H., Budka, M.J.E., Morrison K.C., Hasson, M., (1947) Preparación y propiedades de las proteínas de suero y de plasma. Las propiedades refractivas de las proteínas del plasma humano y ciertas fracciones purificadas. Revista de la Sociedad Americana de Química,, 69, 1747-1753; Barer, R., Joseph, S.,(1954) Refractometría de las células vivas Revista trimestral de la ciencia de la microscopía, 95, 399- 423, Zelmanovic y colaboradores, (1998). Una evidencia reciente indica también una relación lineal entre la densidad de trombocitos (separada por gradientes de estractana) (Corash, L., Tan, H., Gralnick, H., (1997), Heterogeneidad de las sub-poblaciones de trombocitos humanos de sangre completa. Relación lineal entre densidad de flotación, volumen de celdas, y ultraestructura. Sangre, 49, 71-87 y MPC (Chaapman, E.S., Lerea, K.M., Kirk, R., Sorette, M.P., Sanjay, N.S.,Zelmanovic, D.(1998) Monitorización in vitro y actividad de trombocitos ex vivo : comparación de liberación de gránulos alfa, distribución de densidad, adherencia de trombocitos y concentración de componente medio de trombocitos (MPC).. sangre, 92, Suplemento 1, 68B, Resumen 3273). La masa media de trombocitos (en adelante MPM, en pg) se calcula a partir del volumen medio de trombocitos (en adelante MPV) y del MPC Los datos para trombocitos individuales podrían presentarse en histogramas mientras se tabula el valor medio para cada parámetro (Zelmanovic, D., Colella,G.M., Heherington, E.J., Chapman, E.S., 2   Paseltiner, L. (1998) Método y dispositivo automatizados para identificar y cuantificar trombocitos y para determinar el estado de activación de trombocitos usando muestras de sangre completa.US-A- 5817519. La activación de los trombocitos ocurre rápidamente tras la flebotomía o muy poco después, y esta característica de los trombocitos hace difíciles los análisis ex vivo. Sin embargo, la extensión de esta activación in vitro sí depende del anticoagulante en el que se recoja la sangre (Kuhne, T., Horstein, A., Semple, J., Chang, W., Blanchette, V., Freedman, J. (1995) Evaluación citométrica de flujo de activación de trombocitos en sangre recogida en ácido etilendiaminotetraacético (en adelante EDTA) en función de Diatube_H, una solución de citrato de sodio suplementada con teofilina, adenosina, y dipiridamol. Revista Americana de Hematología, 50, 40-45). Por razones de sencillez y economía, el anticoagulante ideal sería el que permitiese obtener información sobre la activación de los trombocitos como parte del perfil total de la sangre . El EDTA, como su sal de tripotasio líquida, se usa comúnmente como anticoagulante, debido a su disponibilidad y a su comodidad de preparación (Perrotta,G., Roberts, L., Glazier, J.,Schumacher, H.R. (1998) Uso del anticoagulante citrato sódico para análisis hematológicos rutinarios sobre el CELL-DYN® 4000: Una oportunidad para aumentar el rendimiento en el laboratorio clínico. Hematología de laboratorio, 4, 156-162.) Es también el anticoagulante preferido para hemogramas y diferencias en números de leucocitos debido a sus propiedades de conservación de células, y es el anticoagulante recomendado para estos fines por el Comité Nacional para Normas Clínicas de Laboratorio (en adelante NCCLS: Norma H1-A4). Cuando se monitoriza la activación de trombocitos ex vivo, los requisitos principales son usar un procedimiento de venopunción que minimice la activación espontánea de trombocitos, y recoger la sangre en un medio que no sólo prevenga la coagulación, sino que también conserve el estado de activación de los trombocitos hasta que se pueda analizar la muestra (George J.N., Thio L.L., Morgan RK (1981) Análisis cuantitativo de glicoproteínas de membrana de trombocitos; efecto del lavado de trombocitos y aislamiento de sub-poblaciones de densidad de trombocitos.. Investigación de trombosis 23, 69-77; Hawiger J (1989) Caminos secretores de trombocitos: una visión de conjunto.Métodos en Enzimología 169, 191-195; Michelson AD (1996) Citometría de flujo: un ensayo clínico de la función de los trombocitos-una revisión. Sangre 87. 4925-4936;Wu KK (1994) Activación de trombocitos y trombosis arterial. Lancer 344, 991-995) Para las investigaciones de trombocitos, el EDTA... [Seguir leyendo]

1. Un método de medir la activación de los leucocitos, que comprende medir un indicador de activación de leucocitos de los leucocitos suspendido en una composición anticoagulante de sangre que comprende uno o más componentes para efectuar la conversión en la forma esférica de los trombocitos o plaquetas de la sangre que comprende EDTA o EGTA o una combinación de los mismos, y al menos un antagonista de trombocitos o plaquetas de la sangre. 2. Un método según la reivindicación 1, en el que los antagonistas de trombocitos o plaquetas de la sangre incluyen a) teofilina, b) adenosina o 2-cloroadenosina, y c) dipiridamol. 3. Un método según la reivindicación 2, en el que la composición anticoagulante de sangre además comprende citrato. 4. Un método según la reivindicación 3, en el que la composición anticoagulante de sangre comprende una mezcla de EDTA y CTAD.   21   22   23