MÉTODO PARA LA PREPARACIÓN ENZIMÁTICA DE CITRONELAL.

La invención se refiere a un método enzimático para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula a partir de aldehídos ß -insaturados, en particular un método para la producción de citronelal. Estado de la técnica El (R)-(+) citronelal es un importante producto químico intermedio, el cual es empleado por ejemplo en la producción de mentol. Los métodos químicos para la producción de (R)-(+) citronelal proveniente de citral requieren procedimientos muy costosos (exclusión de oxígeno y agua), lo cual conduce a elevados costos en una síntesis técnica. Definición del objetivo Fue el objetivo de poner a disposición un método para la producción de citronelal mediante reducción enantioselectiva de citral, el cual suministrara enantiómeros de citronelal tan puros como fuera posible en un elevado rendimiento químico. Descripción de la invención ES 2 367 847 T3 La presente invención se refiere a un método para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula (2) a partir de aldehídos ß- insaturados de la fórmula (1) mediante reducción en presencia de una enoato-reductasa (i) con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o (ii) con una secuencia de polipéptidos la cual exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2. donde R 1 y R 2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4, R 3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada. El método acorde con la invención puede ser ejecutado con aldehídos ,ß insaturados de la fórmula (1), en los cuales R 1 y R 2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4 en reforma ramificada y no ramificada, R 3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada. Los radicales alquilo o alquenilo pueden estar sustituidos también una o varias veces. Son sustratos particularmente adecuados para el método acorde con la invención los aldehídos ,ß -insaturados de la fórmula (1), en los cuales R 1 significa H, R 2 significa CH3 y R 3 significa -CH2-CH2-CH=(CH3)2 (citral en forma cis o trans) y aquellos en los cuales R 1 significa CH3, R 2 significa H y R 3 significa CH3 (2- metil -pent-2-en-1-al). Las enoato-reductasas acordes con la invención empleadas reducen ocasionalmente en forma parcial, aparte del doble enlace en posición ,ß a la función carbonilo, también a la función carbonilo en sí misma, mediante lo que se forma entonces el correspondiente alcohol. Para el método acorde con la invención son enoato-reductasas adecuadas aquellas enzimas que están en capacidad de reducir 2-metil-pent-2-en-1-al en una reacción dependiente de NADPH hasta (S)-2-metil-pentan-1-al. En lo que sigue, se denomina esta reacción también reacción modelo. Además las enoato-reductasas adecuadas para el método acorde con la invención poseen una secuencia de polipéptidos según SEQ ID NO:1 o NO:2 o una secuencia de polipéptidos que exhibe por lo menos 80%, 2 ES 2 367 847 T3 preferiblemente por lo menos 90%, particularmente preferido por lo menos 95% y en particular por lo menos 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2. Un polipéptido con la SEQ ID NO:1 es el gen OYE2 de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae Genlocus YHR179W). Un polipéptido con la SEQ ID NO:2 es el gen OYE3 de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae Genlocus YPL171C). La investigación de la identidad de secuencia para el propósito aquí descrito, debería ocurrir mediante el programa de computador "GAP" del Grupo de Genética por Computador (GCG) de la Universidad de Wisconsin, donde debería usarse la versión 10.3 empleando los parámetros estándar recomendados por GCG. Tales enoato-reductasas pueden ser obtenidas provenientes de SEQ ID NO:1 o 2 mediante métodos conocidos por los expertos de mutagénesis dirigida o aleatoria. Sin embargo, de modo alternativo pueden buscarse también enoato-reductasas en microorganismos, preferiblemente en aquellos de los géneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts), Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia o Yokenella, reductasas que catalizan la reacción modelo arriba mencionada y cuya secuencia de aminoácidos ya exhibe la identidad de secuencia necesaria hacia SEQ ID NO:1 o 2 o es obtenida mediante métodos de mutagénesis. La enoato-reductasa puede ser empleada en forma purificada o parcialmente purificada o también en forma del microorganismo en sí mismo. Los métodos para la obtención y purificación de las deshidrogenasas a partir de microorganismo son ampliamente conocidos por los expertos. La reducción enantioselectiva ocurre preferiblemente con la enoato-reductasa en presencia de un cofactor adecuado (también definido como cosustrato). Como cofactores para la reducción de la cetona sirven comúnmente NADH y/o NADPH. Aparte de ello pueden emplearse también enoato-reductasas como sistemas celulares, los cuales contienen de modo inherente cofactor, o de modo alternativo se añaden mediadores redox (A. Schmidt, F. Hollmann y B. Bühler "Oxidation of Alcohols" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim). La reducción enantioselectiva ocurre preferiblemente con la enoato-reductasa además en presencia de un agente reductor adecuado, el cual regenera al cofactor oxidado en el curso de la reducción. Son ejemplos de agentes reductores adecuados los azúcares, en particular hexosas, como glucosa, manosa, fructosa, y/o alcoholes que pueden oxidarse, en particular etanol, propanol o isopropanol, así como formiato, fosfito o hidrógeno molecular. Para la oxidación del agente reductor y unido a ello para la regeneración de la coenzima puede añadirse una segunda deshidrogenasa, como por ejemplo glucosa-deshidrogenasa en el empleo de glucosa como agente reductor, o formiato-deshidrogenasa en el empleo de formiato como agente reductor. Éste puede emplearse como enzima libre o inmovilizada o en forma de células libres o inmovilizadas. Su producción puede ocurrir tanto separadamente como también mediante coexpresión en una cepa-reductasa (recombinante). Una forma preferida de operar del método reivindicado es la regeneración de los cofactores mediante un sistema enzimático, en el cual se emplea una segunda deshidrogenasa, particularmente preferido una glucosadeshidrogenasa. Otro objetivo de la invención es el empleo de la enoato-reductasa para la producción de citronelal. En esta forma de operar se emplean preferiblemente como cofactores NAD + o bien NADP + , los cuales pueden ser regenerados nuevamente con el correspondiente cosustrato (agente oxidante). Como cosustrato puede emplearse aquí preferiblemente acetona la cual regenera el cofactor con el ADH ya presente y/o una deshidrogenasa empleada adicionalmente, donde es reducida hasta isopropanol. En el marco de la presente invención "enantioselectividad" significa que el exceso de enantiómero ee (en %) del enantiómero S, el cual se calcula de forma conocida según: ee (%)= enantiómero S- enantiómero R / (enantiómero S enantiómero R) x 100 3 ES 2 367 847 T3 es por lo menos 80 %, preferiblemente por lo menos 90 %, en particular por lo menos 95 % y especialmente por lo menos 97 %. Las enoato-reductasas empleadas de acuerdo con la invención pueden emplearse libres o inmovilizadas. Se entiende por enzima inmovilizada una enzima que esta fija sobre un soporte inerte. A partir de las EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 y la DE-OS 100193773 así como de las citas de literatura allí consignadas se conocen materiales de soporte adecuados así como enzimas allí inmovilizadas. A los materiales de soporte adecuados pertenecen por ejemplo arcillas, minerales arcillosos, como caolinita, tierras diatomáceas, perlita, dióxido de silicio, óxido de aluminio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, celulosa en polvo, materiales de intercambio aniónico, polímeros sintéticos como poliestireno, resina acrílica, resina de fenol formaldehído, poliuretanos y poliolefinas como polietileno y polipropileno. Los materiales de soporte son empleados para la producción de enzimas soportadas, comúnmente en forma de partículas muy finas, donde se prefieren las formas porosas. Comúnmente, el tamaño de partícula del material de soporte comúnmente es no mayor a 5 mm, en particular no mayor a 2 mm (curva granulométrica). De modo... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula (2) a partir de aldehídos ß- insaturados de la fórmula (1) mediante reducción en presencia de una enoato-reductasa (i) con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o (ii) con una secuencia de polipéptidos la cual exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2. donde R 1 y R 2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4, R 3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada. 10 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se ejecuta la reducción con NADPH como cofactor. 3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el cofactor empleado es regenerado enzimáticamente. 4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la regeneración del cofactor ocurre mediante glucosadeshidrogenasa. 5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza la reducción en un sistema acuoso. 15 6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la enoato-reductasa está presente inmovilizada. 7. Empleo de una enoato-reductasa ES 2 367 847 T3 (i) con las secuencias de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o (ii) con una secuencia de polipéptidos que exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2, 20 en un método para la producción de (R)-(+) citronelal a partir de citral. 13