Método para el aislamiento de células.

Método para el aislamiento de células rodeadas por una pared celular a partir de una muestra de alimentos

, un fluido corporal, muestra de agua o tejido que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de alimentos, fluido corporal, muestra de agua o tejido,

b) incubar dicha muestra con una solución de extracción que comprende un líquido iónico en concentraciones entre 0,5% y 20% en peso, en base al peso de la mezcla

c) aislar dichas células de la mezcla de la etapa b) mediante centrifugación, filtración, dielectroforesis y ultrasonidos, o afinidad de unión.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/003295.

Solicitante: MERCK PATENT GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: FRANKFURTER STRASSE 250 64293 DARMSTADT ALEMANIA.

Inventor/es: ROSSMANITH, PETER, WAGNER, MARTIN, MESTER,PATRICK JULIAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/20 (Bacterias; Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/24 (Métodos de toma de muestra, de inoculación o desarrollo de una muestra; Métodos para aislar físicamente un microorganismo intacto)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N5/00 (Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00))

PDF original: ES-2529215_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para el aislamiento de células La presente invención hace referencia a un método y un kit para el aislamiento de células de una muestra. La muestra se trata con una solución de extracción que comprende al menos un líquido iónico, lo que da como resultado el aislamiento de, preferiblemente, células viables.

Antecedentes de la invención El aislamiento de células a partir de muestras complejas para su identificación o caracterización o simplemente para un procesamiento adicional, se está volviendo cada vez más importante, en particular la identificación de patógenos en muestras como muestras de comida o muestras clínicas como sangre, tejido o heces. Sin embargo, para identificar claramente y opcionalmente para cuantificar las células comprendidas en una muestra, han de proporcionarse métodos para su aislamiento.

La PCR en tiempo real ha aumentado enormemente el campo de aplicación de la PCR como una herramienta cuantitativa en la biología molecular en general y para la cuantificación e identificación de microorganismos, en particular de patógenos. La PCR en tiempo real permite la detección fiable y la cuantificación hasta un único ácido nucleico diana por reacción en PCR pero requiere un ADN molde sumamente purificado. Especialmente cuando se trata del diagnóstico rutinario y de la detección cuantitativa de bacterias en ambientes complejos tales como los alimentos, estos requerimientos juegan un papel clave, ya que efectos inhibidores causados por componentes de estos ambientes pueden influenciar o incluso inhibir la reacción por PCR. Más aún, es crucial emplear un método de recuperación fiable y eficiente a ser utilizado para el aislamiento de los organismos diana a partir de muestras complejas como alimentos. Debido a que las muestras como alimentos implican, generalmente, volúmenes de muestras grandes, se utilizan normalmente métodos microbiológicos para el aislamiento y enriquecimiento de microorganismos. Estos métodos representan métodos del “estándar de oro” y deben evaluarse nuevas técnicas alternativas en comparación con los mismos.

Se han realizado importantes esfuerzos para establecer métodos para la separación de microorganismos, por ejemplo de bacterias, de alimentos que cumplan con los exigentes requerimientos de la PCR en tiempo real y otros métodos moleculares para el análisis aguas abajo (downstream) de los microorganismos.

Además se ha intentado el aislamiento del ADN directamente de la comida utilizando métodos de aislamiento del ADN utilizados de manera habitual en biología molecular. Otros métodos utilizan la afinidad de las biomoléculas con las estructuras superficiales de los microorganismos, en donde dichas biomoléculas pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, proteínas de unión a bacterias de fagos y péptidos antimicrobianos (AMP por sus siglas en inglés) , opcionalmente en combinación con perlas magnéticas, portaobjetos de vidrio silanizado o transferencia de colonias directa. Por ejemplo, para la detección directa de Listeria monocytogenes puede utilizarse un sistema de separación en dos fases acuoso (Lantz et al. Appl Environ Microbiol. (1994) 60:3416-3418) .

La centrifugación en gradiente de densidad de flotación se ha establecido como una herramienta para la separación de bacterias de matrices de alimentos (Wolffs P. et al .Appl Environ Microbiol. (2005) 71:5759-5764) . Otros métodos están basados en la separación física tal como la centrifugación y filtración simples. También han sido descritos métodos que aplican la digestión enzimática de la matriz de alimentos que utilizan proteinasa K y pronasa y/o extracción química de las bacterias de la comida que utilizan tiocianato de guanidina/fenol/cloroformo, éter dietílico/cloroformo, y citrato de sodio/polietilenglicol. Se describen métodos actuales para el aislamiento de células, en particular microorganismos, a partir de muestras complejas en, por ejemplo, Stevens KA and Jaykus L-A (Crit Rev Microbiol (2004) 30:7-24) .

La mayoría de estos métodos presentan desventajas como el tamaño insuficiente del volumen de muestra procesado, elevadas limitaciones de detección, tasas de recuperación bajas, aislamiento de células viables no cuantitativo, procedimientos que consumen mucho tiempo y costes elevados. Además la aplicación de estos métodos se ha restringido en la mayoría de los casos a únicamente una o a un número limitado de matrices de alimentos. En base a los requerimientos para la cuantificación directa de bacterias en alimentos, que son (i) un volumen de muestra grande, (ii) una tasa de recuperación reproducible sobre un amplio rango de concentración diana, y (iii) eliminación de inhibidores para ayudar a los métodos alternativos en el análisis aguas abajo, se han de proporcionar nuevos protocolos para la separación de células y microorganismos, como el patógeno alimenticio L. monocytogenes.

El documento WO 2008/017097 revela un método para el aislamiento de células a partir de matrices complejas, como productos alimenticios. Este método utiliza un tampón de extracción que comprende un agente caotrópico en combinación con un detergente.

Otra cuestión clave en el análisis de alimentos es la determinación de la viabilidad de las bacterias contaminantes. Hasta ahora la mayoría de los métodos no pueden distinguir entre células viables y células bacterianas muertas. Además de lisar la a menudo compleja matriz de muestras de alimentos, se necesitan condiciones de lisis que tengan un impacto negativo en la viabilidad de las células que van a ser aisladas a partir de tales muestras. Este problema reduce el beneficio de utilizar, por ejemplo, métodos de PCR para la monitorización rutinaria en el análisis de alimentos. Por un lado, algunas células resultan muertas durante la extracción, por otro lado, también se extraen y se determinan células no viables o dañadas que ya han estado presentes en la muestra antes de la extracción, aunque no tienen ningún efecto adicional en la calidad de la muestra.

O.F. D’Urso et al., en Food Microbiology 26 (2009) 311-316 han desarrollado un método basado en la filtración para el aislamiento de células viables. El tampón utilizado en este método comprende cantidades elevadas del agente caotrópico tiocianato de guanidina que a menudo interfiere con los procesos aguas abajo y por tanto ha de ser eliminado con procedimientos de lavado complicados.

En consecuencia, existe una clara necesidad de métodos reproducibles y cuantitativos para el aislamiento de células a partir de matrices complejas como alimentos y sangre con la posibilidad de aislar células viables.

Breve descripción de la invención Se ha observado que los contaminantes celulares como las bacterias pueden ser aislados de forma muy efectiva de matrices complejas utilizando un tampón que comprende al menos un líquido iónico. Además, debido a las condiciones muy suaves pero efectivas de extracción, este método permite el aislamiento de células viables.

Por lo tanto la presente invención hace referencia a un método para el aislamiento de células rodeadas por una pared celular a partir de una muestra de alimentos, un fluido corporal, agua o una muestra de tejido que comprende las etapas de:

a) proporcionar dicha muestra,

b) incubar dicha muestra con una solución de extracción que comprende al menos un líquido iónico en concentraciones entre 0, 5 y 20% en peso en base al peso de la mezcla,

c) aislar dichas células de la mezcla de la etapa b) , mediante centrifugación, filtración, dielectroforesis y ultrasonido o afinidad de unión.

Descripción de la invención Resultó de manera sorprendente que la incubación de una muestra compleja con una solución de extracción que comprende... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para el aislamiento de células rodeadas por una pared celular a partir de una muestra de alimentos, un fluido corporal, muestra de agua o tejido que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de alimentos, fluido corporal, muestra de agua o tejido, 5 b) incubar dicha muestra con una solución de extracción que comprende un líquido iónico en concentraciones entre 0, 5% y 20% en peso, en base al peso de la mezcla c) aislar dichas células de la mezcla de la etapa b) mediante centrifugación, filtración, dielectroforesis y ultrasonidos,

o afinidad de unión.

2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque al menos un 30% de las células aisladas en la etapa c) 10 son células viables.

3. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque las células son células bacterianas.

4. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución de extracción no comprende un detergente.

5. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a la muestra se añade una 15 cantidad definida de células de control previamente a la etapa b) .

6. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra se incuba previamente con un compuesto que muestra propiedades protectoras ante el estrés osmótico para las células.

7. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la muestra se incuba además con al menos una enzima de degradación de biopolímeros.

8. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en una etapa adicional d) las células se analizan mediante recuento celular, métodos de PCR, utilizando lectinas o mediante métodos que implican anticuerpos, péptidos antimicrobianos (AMP) , aptámeros o dominios de unión viral, dirigidos a las estructuras superficiales de dichas células.