Método para el diagnóstico de la esclerosis múltiple en un sujeto,

comprendiendo el método la detección en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto un anticuerpo anti-Glc(α1,6)Glc(α), y la comparación de los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los de una muestra de control, en el que dicha muestra de control se selecciona de entre el grupo que consiste de uno o más individuos que presentan síntomas de esclerosis múltiple y que presentan un estado de esclerosis múltiple conocido, y uno o más individuos que no manifiestan síntomas de esclerosis múltiple, diagnosticando de esta manera esclerosis múltiple en dicho sujeto

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere de manera general a un método y a reactivos para el diagnóstico y evaluación de la prognosis de la esclerosis múltiple, y más particularmente a un método y a reactivos para el diagnóstico y la evaluación de la prognosis de la esclerosis múltiple mediante la medición de los niveles de anticuerpos contra glicanos en una muestra biológica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria autoinmunológica crónica del sistema nervioso central. Es una causa común de discapacidad persistente en adultos jóvenes. En pacientes que sufren MS, el sistema inmunológico destruye la capa de mielina de los axones en el cerebro y en la médula espinal, provocando una diversidad de patologías neurológicas. En la forma más común de MS, a episodios de recaída-remisión (RRMS) de empeoramiento agudo de la función neurológica (exacerbaciones, ataques) siguen periodos de recuperación parcial o completa (remisiones) sin que avance la enfermedad (estables). [0003] Para diagnosticar MS en un paciente deben registrarse dos sucesos separados. Se ha informado de que la mayoría de pacientes con MS inicialmente se presentan con un síndrome clínicamente aislado debido a una lesión desmielinizante inflamatoria en el nervio óptico, tallo cerebral o médula espinal. Aproximadamente 50 por ciento de aquellos pacientes que presentan un síndrome clínicamente aislado progresan a MS clínicamente definitiva (CDMS) dentro de los 37 meses posteriores a la presentación. Aproximadamente 40% a 50% progresan a una MS clínicamente definitiva dentro de los 18 meses posteriores a la evaluación mediante resonancia magnética (MRI). La progresión posterior de la enfermedad puede variar significativamente de paciente a paciente. La progresión puede variar entre un curso benigno, un curso clásico de recaída-remisión, crónico progresivo y un raro curso fulminante. [0004] Un método para diagnosticar la MS que facilita el diagnóstico precoz y la predicción del avance o nivel de actividad de la enfermedad (benigna, moderada y maligna) resultaría valioso para controlar la enfermedad y proporcionar recomendaciones al paciente. Por ejemplo, a los pacientes diagnosticados precozmente de un curso activo de MS se les podrían ofrecer tratamientos que resulten beneficiosos para la MS temprana. Además, los pacientes que presentan un riesgo de un avance más rápido y que sufrirán un suceso clínico adicional en el futuro próximo se beneficiarían de un tratamiento más agresivo que ayudaría a retrasar estos potenciales sucesos futuros. [0005] Los métodos actuales para la evaluación y seguimiento del avance de la MS se basan en la evaluación y clasificación de la función de los pacientes durante los ataques y de las discapacidades acumuladas durante los ataques. Una evaluación utilizada para evaluar la MS es la escala extendida de estado de discapacidad (EDSS). Sin embargo, el sistema de puntuación EDSS no predice el avance de la enfermedad. Además, la puntuación EDSS puede ser variable debido a que se basa en una evaluación subjetiva de la función del paciente. Entre los métodos para el diagnóstico pueden incluirse el seguimiento de las lesiones cerebrales mediante MRI o el ensayo del líquido cerebroespinal (CSF) para la formación de bandas oligoclonales (OCB). La MRI es un método físico para evaluar las lesiones cerebrales y se utiliza ampliamente para el diagnóstico de la MR. Sin embargo, típicamente ofrece únicamente un valor predictivo del muy largo plazo, y la correlación entre los resultados de la MRI y la actividad de la enfermedad puede ser reducida. De esta manera, la MRI, la OCB o cualquier otro ensayo existente no puede utilizarse para proyecciones a corto plazo del avance y nivel de actividad de la enfermedad o para el control de la misma. [0006] La punción cerebroespinal es un procedimiento invasivo incómodo que no resulta adecuado para el uso rutinario o la prognosis. Además, ambos métodos evalúan daños sólo después de que se hayan producido; ningún método puede predecir la aparición de ataques o las lesiones subclínicas silenciosas. Una desventaja adicional de los métodos anteriormente indicados como modo para diagnosticar la MS es que una OCB o MRI negativa no descarta la existencia de la MS. [0007] La mayoría de pacientes con MS inicialmente se presentan con un síndrome clínicamente aislado (CIS). A pesar del hecho de que la MS se desarrolla en hasta 80% de estos pacientes, el curso de la enfermedad y el tiempo hasta la conversión es impredecible en el momento de su aparición. La enfermedad podría permanecer inactiva durante muchos años antes de que la aparición de una segunda recaída clínica o nuevas lesiones en una MRI confirmasen el diagnóstico. Debido a que la terapia actualmente disponible sólo resulta parcialmente efectiva y los efectos secundarios son habitualmente, muchos neurólogos no saben si tratar todos los pacientes de este tipo con inmunomoduladores, o esperar hasta confirmar el diagnóstico a partir de un segundo suceso clínico o la aparición de nuevas lesiones en la MRI. Además, no debe utilizarse una terapia agresiva y potente aprobada debido a los efectos secundarios asociados a la terapia, a la falta de información sobre el curso de la enfermedad y/o al avance esperado de la enfermedad. [0008] Existe una necesidad de un ensayo serológico simple que pueda predecir: i) si los pacientes en el momento de un primer suceso neurológico (FNE) o CIS sugerente de MS desarrollarán MS dentro de una determinada ventana de tiempo, ii) si una MS de recaída-remisión recién diagnosticada presentará un curso de la enfermedad más activo, que por lo tanto podría requerir un tratamiento agresivo, o iii) si el paciente de MS recién diagnosticado seguirá un curso relativamente benigno que permita al paciente posponer la terapia inmunomoduladora hasta que resulte necesaria. Este ensayo también resultaría útil para ayudar a diagnosticar, evaluar el avance de la MS y

controlar el tratamiento de la misma. Existe además un necesidad no satisfecha de desarrollo de biomarcadores específicos basados en suero para el diagnóstico y prognosis de la MS de recaída-remisión (RRMS). [0009] La patente WO nº 01/14881 describe la utilización de determinados anticuerpos como marcado-res de la MS. Schwars et al., Glycobiology 13:749-754, 2003, describen una matriz de carbohidratos que puede utilizarse para detectar anticuerpos anti-carbohidrato.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en parte en el descubrimiento de que los pacientes de MS presentan niveles séricos más altos de anticuerpos IgM que se unen a las estructuras de glicano sintetizadas Glc(1,2)Glc() o Glc(1,3)Glc() o Glc(1,6)Glc() en comparación con los niveles séricos de estos anticuerpos en individuos con otras enfermedades neurológicas (tanto crónicas, inflamatorias como no inflamatorias). Los niveles de anticuerpos de tipo IgM de Glc(1,6)Glc() en suero solo o en combinación con anti-Glc(1,2)Glc() o Glc(1,3)Glc() pueden actuar como diagnóstico de la enfermedad de MS, y como biomarcadores de estadificación y prognosis para la presencia, severidad y actividad de la enfermedad de MS. Los niveles de los anticuerpos también pueden utilizarse para seleccionar el trata-miento apropiado y para realizar un seguimiento de la eficacia del tratamiento. [0011] La medición de los niveles de dichos anticuerpos en la sangre de pacientes que se sospecha que presentan MS facilita el diagnóstico precoz rápido y económico de los pacientes de MS, la predicción de la actividad de la enfermedad y, en el caso indicado, la prescripción temprana de fármacos modificadores de la enfermedad. El seguimiento de los niveles de dichos anticuerpos en la sangre de pacientes definidos de MS también permite un seguimiento rápido y económico de los efectos de los fármacos prescritos y la detección precoz de ataques o lesiones subclínicas silenciosas, proporcionando de esta manera un mejor tratamiento. [0012] Entre las ventajas adicionales de la invención se encuentran que la existencia de MS en los pacientes puede determinarse en un estadio más temprano de la enfermedad, cuando sus síntomas pueden resultar similar a muchas otras enfermedades similares a la MS o cuando los síntomas todavía no son suficientes para realizar un diagnóstico definitivo de MS. El diagnóstico precoz permite a los médicos tratar la MS antes durante el curso de la enfermedad, minimizando o previniendo de esta manera los daños causados por la destrucción de la mielina y las discapacidades producidas por esta destrucción. Además, los métodos dados a conocer en la presente memoria permiten a los médicos realizar un seguimiento de los pacientes... [Seguir leyendo]

1. Método para el diagnóstico de la esclerosis múltiple en un sujeto, comprendiendo el método la detección en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto un anticuerpo anti-Glc(1,6)Glc(), y la comparación de los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los de una muestra de control, en el que dicha muestra de control se selecciona de entre el grupo que consiste de uno o más individuos que presentan síntomas de esclerosis múltiple y que presentan un estado de esclerosis múltiple conocido, y uno o más individuos que no manifiestan síntomas de esclerosis múltiple, diagnosticando de esta manera esclerosis múltiple en dicho sujeto.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en dicha muestra de ensayo obtenida de dicho sujeto un anticuerpo anti-Glc(1,2)Glc() o un anticuerpo anti-Glc(1,3)Glc(), y comparar los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los de una muestra de control, en el que dicha muestra de control se selecciona de entre el grupo que consiste de uno o más individuos que presentan síntomas de esclerosis múltiple y que presentan un estado de esclerosis múltiple conocido, y uno o más individuos que no manifiestan síntomas de esclerosis múltiple, diagnosticando de esta manera esclerosis múltiple en dicho sujeto.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en dicha muestra de ensayo obtenida de dicho sujeto un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste de un anticuerpo anti-Glc(1,2)Glc() y un anticuerpo anti-Glc(1,3)Glc(), y comparar los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los niveles de dicho anticuerpo en una muestra de control, en el que dicha muestra de control se deriva de uno o más individuos cuyo estado de exacerbación de esclerosis múltiple es conocido, diagnosticando de esta manera la exacerbación de la esclerosis múltiple en dicho sujeto.

4. Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en dicha muestra de ensayo obtenida de dicho sujeto un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste de un anticuerpo anti-Glc(1,2)Glc() y un anticuerpo anti-Glc(1,3)Glc(), y comparar los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los niveles de dicho anticuerpo en una muestra de control, en el que dicha muestra de control se deriva de uno o más individuos cuya actividad de la enfermedad de esclerosis múltiple es conocida, evaluando de esta manera la actividad de esclerosis múltiple en dicho sujeto.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método comprende además detectar en dicha muestra de ensayo obtenida de dicho sujeto un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste de un anticuerpo antiGlc(1,2)Glc() y un anticuerpo anti-Glc(1,3)Glc(), y comparar los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los niveles de dicho anticuerpo en una muestra de control, en el que dicha muestra de control se deriva de uno o más individuos cuya progresión de la enfermedad de esclerosis múltiple es conocida, determinando de esta manera la progresión de la enfermedad en dicho paciente.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método comprende además detectar un segundo anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste de un anticuerpo anti--Glc, un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc(), un anticuerpo anti--GlcNAc, un anticuerpo anti--GlcNAc, un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc(), un anticuerpo anti--Glc, un anticuerpo anti--Ga., un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc(), un anticuerpo anti-GlcNAc(1,4)GlcNAc(), un anticuerpo anti--L-Araf, un anticuerpo anti--L-Rha, un anticuerpo anti-Gal(1,3)[GlcNAc(1,6)]GalNAc(), un anticuerpo anti-Gal(1,4)GlcNAc(), un anticuer-po anti-Gal(1,3)GalNAc(), un anticuerpo anti-Gal(1,3)GlcNAc(), un anticuerpo anti--GlcA y un anticuerpo anti--Xyl, y comparar los niveles del segundo anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los niveles del segundo anticuerpo en una muestra de control, en el que dicha muestra de control se selecciona de entre el grupo que consiste de uno o más individuos que presentan síntomas de esclero-sis múltiple y que presentan un estado de esclerosis múltiple conocido, y uno o más individuos que no manifiestan síntomas de esclerosis múltiple, diagnosticando de esta manera la esclerosis múltiple en dicho sujeto.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti--Glc, un anticuerpo antiGlc(1,4)Glc() o un anticuerpo anti--GlcNAc.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de control consiste esencialmente de una población de uno o más individuos que:

(a) presentan síntomas de esclerosis múltiple con un estado de esclerosis múltiple conocido, o

(b) presentan una enfermedad autoinmunológica diferente de la esclerosis múltiple, o

(c) presentan una enfermedad neurológica diferente de la esclerosis múltiple.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de tipo IgM.

10. Método según la reivindicación 6, en el que:

(a) dicho anticuerpo anti--Glc es un anticuerpo de tipo IgM, o

(b) dicho anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc() es un anticuerpo de tipo IgM, o

(c) dicho anticuerpo anti--GlcNAc es un anticuerpo de tipo IgM.

11. Método según la reivindicación 1, en el que dicho diagnóstico es un diagnóstico precoz de esclerosis múltiple.

12. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo se detecta utilizando un oligosacárido que incluye un glicano que contiene un Glc(1,2)Glc() (GAGA2) o Glc(1,3)Glc() (GAGA3) o Glc(1,6)Glc() (GAGA6).

13. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo se detecta utilizando un polímero que incluye un glicano que contiene un Glc(1,2)Glc() (GAGA2) o Glc(1,3)Glc() (GAGA3) o Glc(1,6)Glc() (GAGA6).

14. Método según la reivindicación 13, en el que:

(a) dicho polímero es un polisacárido, o

(b) dicho polímero es un lipopolisacárido (LPS), o

(c) dicho polímero es un polímero natural, o

(d) dicho polímero es un polímero sintético.

15. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de control se determina utilizando una evaluación de escala extendida de estado de discapacidad (EDSS) o una evaluación mediante obtención de imágenes de resonancia magnética (MRI).

16. Método según la reivindicación 2 ó 6, en el que:

(a) dicho método comprende detectar por lo menos dos de dichos anticuerpos, o

(b) dicho método comprende detectar por lo menos cuatro de dichos anticuerpos, o

(c) dicho método comprende detectar por lo menos seis de dichos anticuerpos.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4 ó 5, en el que dicho método comprende detectar tres de dichos anticuerpos en dicha muestra.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que dicha muestra de control consiste esencialmente de:

(a) una población de uno o más individuos en estado de remisión de esclerosis múltiple que no muestran síntomas de una exacerbación de esclerosis múltiple, y se diagnostica una exacerbación de esclerosis múltiple en dicho sujeto en el caso de que se encuentre más de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo que en dicha muestra de control, o

(b) una población de uno o más individuos que presentan un estado de exacerbación de esclerosis múltiple, que manifiestan síntomas de una exacerbación de esclerosis múltiple, y se diagnostica una exacerbación de esclerosis múltiple en dicho sujeto en el caso de que se encuentren niveles similares de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo y en dicha muestra de control.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra de ensayo es un líquido biológico.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicho líquido biológico es sangre completa, suero, plasma, líquido de médula espinal, orina, lágrimas o saliva.

21. Método según la reivindicación 19, en el que dicho líquido biológico es suero.

22. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho diagnóstico es un diagnóstico precoz de exacerbación de esclerosis múltiple.

23. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho sujeto ha sido tratado mediante:

(a) administración subcutánea de interferón beta, o

(b) administración subcutánea de acetato de glatirámero.

24. Método según la reivindicación 5, en el que dicha muestra de control consiste esencialmente de una población de uno o más individuos en estado de remisión de esclerosis múltiple que no manifiestan síntomas de una exacerbación de esclerosis múltiple, y se diagnostica una exacerbación de esclerosis múltiple en dicho sujeto en el caso de que se encuentre más de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo que en dicha muestra de control.

25. Método para identificar un sujeto con un primer suceso neurológico (FNE) que es probable que progrese a esclerosis múltiple de recaída-remisión (RRMS), comprendiendo el método: proporcionar una muestra de ensayo de un sujeto con un FNE, detectar en dicha muestra de ensayo de dicho sujeto con un FNE, un anticuerpo anti-Glc(1,6)Glc() (GAGA6), y comparar los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con los de una muestra de control cuyo estado de RRMS es conocido, identificando de esta manera un sujeto de FNE que es probable que progrese a RRMS.

26. Método según la reivindicación 25, en el que dicho sujeto con un FNE presenta síntomas de un síndrome clínicamente aislado (CIS).

27. Método según la reivindicación 25, en el que dicho método comprende además detectar un anticuerpo antiGlc(1,4)Glc() GAGA4.

28. Método según la reivindicación 25, en el que dicha muestra de control consiste esencialmente de una población de uno o más individuos que no manifiestan RRMS, y se identifica que el sujeto es probable que progrese a RRMS en el caso de que dicho anticuerpo se encuentre presente a niveles más altos en dicha muestra de ensayo que en dicha muestra de control.

29. Método según la reivindicación 28, en el que dicha muestra de control incluye sujetos con otra enfermedad neurológica (OND).

30. Método según la reivindicación 25, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de tipo IgM.

31. Método según la reivindicación 27, en el que dichos anticuerpos son anticuerpos de tipo IgM.

32. Método según la reivindicación 25, en el que dicho anticuerpo se detecta utilizando:

(a) un glicano que contiene Glc(1,6)Glc() (GAGA6), o

(b) un oligosacárido que incluye un glicano que contiene un Glc(1,6)Glc() (GAGA6), o

(c) un polímero que incluye un glicano que contiene un Glc(1,6)Glc() (GAGA6).

33. Método según la reivindicación 32, en el que dicho polímero es:

(a) un polisacárido, o

(b) un LPS, o

(c) un polímero natural, o

(d) un polímero sintético.

34. Método para identificar un sujeto con un primer suceso neurológico (FNE) que es probable que progrese a esclerosis múltiple de recaída-remisión (RRMS), comprendiendo el método: obtener una muestra de suero de un sujeto con un FNE, detectar en dicha muestra de suero de dicho sujeto con un FNE un anticuerpo IgM anti-Glc(1,6)Glc() (GAGA6), y detectar un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc() GAGA4, comparar los niveles de dichos anticuerpos en dicha muestra de ensayo con los de una muestra de control que es conocido que presenta RRMS, en el que un nivel elevado de dichos anticuerpos en dicha muestra de ensayo en comparación con los de dicha muestra de control indica que dicho sujeto de FNE es probable que progrese a RRMS.

35. Kit para el diagnóstico de síntomas asociados, que determinan la prognosis o que evalúan la actividad de la esclerosis múltiple en un sujeto, comprendiendo el kit:

un primer reactivo que detecta específicamente un anticuerpo anti-Glc(1,6)Glc(), un segundo reactivo que detecta específicamente un segundo anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste de un anticuerpo anti--Glc, un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc(), un anticuerpo anti--GlcNAc, un anticuerpo anti--GlcNAc, un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc(), un anticuerpo anti--Glc, un anticuerpo anti--Gal, un anticuerpo anti-Glc(1,4)Glc(,4)Glc(), un anticuerpo anti-GlcNAc(1,4)GlcNAc(), un anticuerpo anti--L-Araf, un anticuerpo anti--L-Rha, un anticuerpo anti-Gal(1,3)[GlcNAc(1,6)]GalNAc(), un anticuerpo anti-Gal(1,4)GlcNAc(), un anticuerpo anti-Gal(1,3)GalNAc(), un anticuerpo anti-Gal(1,3)GlcNAc(), un anticuerpo anti--GlcA y un anticuerpo anti--Xyl.

36. Kit según la reivindicación 35, que comprende además un reactivo que detecta específicamente un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste de un anti-Glc(¬1,2)Glc() y un anticuerpo anti-Glc(1,3)Glc().

37. Kit según la reivindicación 35, que comprende además un reactivo que detecta específicamente un anticuerpo de tipo IgM.

38. Kit según la reivindicación 35, en el que dicho segundo reactivo detecta específicamente un anticuerpo antiGlc(1,4)Glc() (GAGA4).

39. Composición purificada que comprende: un glicano que contiene Glc(1,2)Glc(¬), un glicano que contiene Glc(1,3)Glc(), y un glicano que contiene Glc(1,6)Glc().

40. Composición según la reivindicación 39, que comprende además un glicano que contiene Glc(1,4)Glc().

41. Composición según la reivindicación 39, que comprende además un glicano que contiene -GlcNAc. 5

42. Composición según la reivindicación 39, en la que por lo menos uno de dichos glicanos se proporciona en un oligosacárido compuesto de entre 1 y 20, entre 2 y 18, entre 3 y 15 ó entre 5 y 12 monómeros.

43. Composición según la reivindicación 39, en la que por lo menos se encuentra presente uno de dichos glicanos: 10

(a) en un polisacárido, o

(b) en un lipopolisacárido (LPS).

44. Composición según la reivindicación 39, en la que por lo menos uno de dichos glicanos se inmoviliza sobre un 15 sustrato sólido.