Método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula que comprende:

a) combinar

i) soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a ácido nucleico,

ii) una célula y

iii) un reactivo, en el que el reactivo comprende un componente de lisis que provoca la lisis de la célula y un agente de precipitación de ácido nucleico que provoca la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida;

produciendo de ese modo una combinación;

b) mantener la combinación en condiciones en las que se produce la lisis de la célula y el ácido nucleico de la célula se une de manera reversible a los soportes en fase sólida, produciendo de eso modo soportes en fase sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos;

c) separar los soportes en fase sólida de la combinación;

d) poner en contacto los soportes en fase sólida con un tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los soportes en fase sólida,

separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula

Método para aislar ácidos nucleicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para aislar ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

Muchas aplicaciones de biología molecular, tales como electroforesis capilar, secuenciación de nucleótidos, clonación con transcripción inversa y protocolos de terapia génica, que contemplan la transfección, la transducción o la microinyección de células de mamífero, requieren el aislamiento de preparaciones de ácido nucleico de alta calidad.

La llegada de aplicaciones de biología molecular exigentes ha aumentado la necesidad de protocolos de purificación de alto rendimiento, y de manera preferible fácilmente automatizables, que puedan producir preparaciones de ácido nucleico de alta calidad. Aunque los avances tecnológicos recientes y la llegada de la robótica han facilitado la automatización de las reacciones de secuenciación y las etapas de lectura en gel, el rendimiento todavía está limitado por la disponibilidad de los métodos fácilmente automatizables de purificación de ácido nucleico.

Sumario de la invención

Tal como se describe en el presente documento, los solicitantes proporcionan un método en el que ácido nucleico genómico de una célula puede separarse de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico (por ejemplo, ADN de plásmido) de la célula, directamente desde un cultivo de crecimiento celular. Además, los solicitantes proporcionan un método en el que el ácido nucleico genómico de una célula puede separarse de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en un lisado celular, sin la necesidad de preparar un lisado clarificado.

La lisis alcalina tradicional requiere las siguientes etapas: concentrar o aglomerar células diluidas en medios de crecimiento; centrifugar o agitar con vórtex; lisar las células con un detergente alcalino; sacudir y/o agitar el lisado; añadir tampón de neutralización; filtrar y/o manipular la muestra para eliminar la masa floculenta; añadir un soporte en fase sólida y añadir tampón de unión. Generalmente se requieren etapas de purificación adicionales para eliminar los detergentes y las sales como sigue: adición de soportes en fase sólida y adición de un tampón de unión.

El documento WO 02/055727 da a conocer el aislamiento de ADN dependiente del tamaño que usa perlas magnéticas recubiertas con COOH seleccionando una concentración apropiada del reactivo precipitante (polialquilenglicol y sal).

El aislamiento de ADN de plásmido tal como se muestra a modo de ejemplo consiste en dos etapas: eliminar en primer lugar el ADN genómico con perlas magnéticas y unir después el ADN de plásmido en la disolución restante a nuevas perlas.

Una ventaja de la invención es que permite un procedimiento simplificado para separar el ácido nucleico genómico de una célula de ácidos nucleicos que tienen un peso molecular menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico de la célula. Proporcionando soportes en fase sólida y un reactivo que provoca la lisis de las células y la precipitación del ácido nucleico de las células sobre los soportes en fase sólida (un agente de precipitación de ácido nucleico), pueden eliminarse una o más etapas del procedimiento de purificación convencional de ácido nucleico a partir de células completas o intactas. Además, proporcionando soportes en fase sólida y un reactivo que provoca la precipitación del ácido nucleico de las células sobre los soportes en fase sólida, pueden eliminarse una o más etapas del procedimiento de purificación convencional de ácido nucleico a partir de lisados celulares. El orden en el que se combinan los soportes en fase sólida y el reactivo con una célula o un lisado celular no es crítico. Los soportes en fase sólida y el reactivo que provoca la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida y/o la lisis de las células, pueden combinarse con una célula o un lisado celular secuencialmente (por ejemplo, como componentes separados) o simultáneamente (por ejemplo, como un solo componente). Cuando se combinan los soportes en fase sólida y el reactivo en un solo componente, los métodos descritos en el presente documento permiten la adición de un único reactivo a una célula o un cultivo celular, seguida por una incubación, una separación de un soporte en fase sólida y una elución selectiva para conseguir la separación del ácido nucleico genómico de una célula del ácido nucleico de una célula que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico de la célula. Los métodos de la invención no requieren ajustes de pH. El número reducido de etapas proporcionadas por los reactivos y métodos descritos en el presente documento simplifican la automatización del procedimiento de purificación de ácido nucleico de células o lisados celulares.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula (por ejemplo, ADN de plásmido, ADN episómico, ADN mitocondrial, ADN de orgánulo, ADN viral) que comprende combinar i) soportes en fase sólida (por ejemplo, micropartículas magnéticas) cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional (por ejemplo, grupo carboxilo, grupo amino) que se une de manera reversible a ácido nucleico, ii) una célula y iii) un reactivo, en el que el reactivo provoca la lisis de la célula y la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida, produciendo de ese modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que se produce la lisis de la célula y el ácido nucleico de la célula se une de manera reversible a los soportes en fase sólida; produciendo de ese modo soportes en fase sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos. Los soportes en fase sólida se separan de la combinación y se ponen en contacto con un tampón de elución (por ejemplo, agua) que provoca la elución (elución selectiva) del ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los soportes en fase sólida. El ácido nucleico genómico permanece unido al soporte en fase sólida, dando como resultado de ese modo la separación del ácido nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula.

En el método según la presente invención, el ácido nucleico que tiene un menor peso molecular es ácido nucleico de plásmido y los soportes en fase sólida comprenden micropartículas paramagnéticas. El reactivo puede ser un alcohol tal como etanol, isopropanol, polialquilenglicol.

La presente invención también se refiere a un método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula que comprende combinar i) soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a ácido nucleico, ii) un lisado celular y iii) un reactivo, en el que el reactivo provoca la precipitación del ácido nucleico del lisado celular sobre los soportes en fase sólida, produciendo de ese modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las el ácido nucleico del lisado celular se une de manera reversible a los soportes en fase sólida, produciendo de ese modo soportes en fase sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos. Los soportes en fase sólida se separan de la combinación y se ponen en contacto con un tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los soportes en fase sólida. El ácido nucleico genómico permanece unido al soporte en fase sólida, separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración del protocolo para la separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico en la célula.

La figura 2 es...

1. Método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula que comprende:

separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula.

2. Método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula que comprende:

separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico que tiene un menor peso molecular se selecciona del grupo que consiste en: ácido nucleico de plásmido, ácido nucleico episómico, ácido nucleico mitocondrial, ácido nucleico de orgánulo y ácido nucleico viral.

4. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los soportes en fase sólida comprenden micropartículas paramagnéticas.

5. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico que tiene un menor peso molecular es ácido nucleico de plásmido y los soportes en fase sólida comprenden micropartículas paramagnéticas.

6. Método según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que las micropartículas paramagnéticas tienen una superficie recubierta en el que la superficie recubierta se selecciona del grupo que consiste en: una superficie recubierta con grupo carboxilo, una superficie recubierta con grupo amina y una superficie recubierta con grupo carboxilo encapsulado.

7. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el reactivo comprende un alcohol.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el alcohol se selecciona del grupo que consiste en: etanol, isopropanol y polialquilenglicol.

9. Método según la reivindicación 7, en el que el reactivo comprende además una sal.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en: NaCl, LiCl y MgCl₂.

11. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tampón de elución comprende agua.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el tampón de elución comprende ARNasa.

13. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los soportes en fase sólida se separan de la combinación usando un método seleccionado del grupo que consiste en: aplicar un campo magnético, aplicar filtración a vacío y aplicar centrifugación.

14. Método según la reivindicación 2, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula bacteriana, una célula que contiene ácido nucleico viral y una célula de mamífero.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la célula de mamífero es una célula de sangre completa.