MÉTODO PARA OBTENER INFORMACIÓN ÚTIL PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES.

Método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares.

Procedimiento para obtener, a partir de la biopsia de un paciente, nuevos parámetros que permiten diagnosticar de manera objetiva diferentes enfermedades neuromusculares y su grado de afectación al paciente, que comprende:

- realizar una tinción de la biopsia para resaltar las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio;

- obtener una imagen de la biopsia tras la tinción;

- segmentar la imagen para identificar los contornos de las fibras musculares;

- formar una red donde las fibras musculares constituyen nodos y los contactos entre fibras musculares constituyen las uniones entre los nodos;

- formar un vector característico de la biopsia cuyos elementos se eligen entre parámetros geométricos de las fibras y parámetros de la red construida; y

- comparar biopsias control y afectas por medio de ACP utilizando en cada caso el vector característico seleccionado.

MÉTODO PARA OBTENER INFORMACIÓN ÚTIL PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención es un método para obtener, a partir de la biopsia de un paciente, un conjunto de nuevos parámetros que permiten, mediante un estudio histológico comparativo, diagnosticar de manera objetiva diferentes enfermedades neuromusculares y su grado de afectación al paciente. Además, el método puede realizarse de manera automática por ordenador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El músculo esquelético constituye el músculo voluntario y está inervado por las neuronas motoras del sistema nervioso somático. El músculo esquelético está constituido por células tubulares muy largas, también denominadas fibras musculares, cuyos diámetros oscilan entre 10 y 100 micras y que contienen muchos núcleos ubicados en la periferia de la célula. Las fibras musculares están separadas unas de otras por una red de tejido conectivo laxo compuesto de fibras de colágeno y reticulares denominado endomisio. A su vez, las fibras musculares se agrupan formando fascículos, que están rodeados por un tejido conectivo denominado perimisio.

Las fibras musculares pueden ser de dos tipos normalmente denominados tipo I y tipo II, estando dispuestos ambos tipos de fibras según un mosaico desordenado a lo largo de los fascículos (Helliwell, 1999; O'Ferrall and Sinnreich, 2009; Pette and Staron, 2000) . El tipo de fibra muscular depende de la naturaleza de la neurona motora que la inerva:

Fibras tipo I: Contienen una isoforma de miosina que utiliza ATP a baja velocidad. Son fibras de contracción lenta.

Fibras tipo II: Contienen una isoforma de miosina que utiliza ATPasa aalta velocidad. Son fibras de contracción rápida.

El diagnóstico de las enfermedades neuromusculares está principalmente basado en la caracterización histológica y la evaluación morfológica de secciones de muestras musculares, normalmente biopsias del músculo esquelético (Dubowitz and Sewr y , 2006) . Para este diagnóstico, es de vital importancia la determinación del tamaño y de las proporciones entre los dos tipos de fibras, así como el tamaño de las fibras de colágeno, ya que el tipo de problema en los componentes de la conexión muscular (neurona motora-axón-músculo) se refleja en un patrón característico de la sección muscular.

Principalmente se pueden distinguir tres patrones característicos correspondientes a dos grupos de enfermedades:

1) Miopatía con origen en el propio músculo

a. Patrón distrófico: Se caracteriza por un aumento de endomisio debido a la aparición de fibrosis. Las fibras adquieren una morfología más redondeada. La afectación suele ser homogénea dentro del músculo, y afecta a todos los músculos. No es frecuente la selectividad de afectación entre fibras tipo I y tipo II.

b. Patrón no distrófico: Las fibras adquieren también una morfología más redondeada, aunque sin aumento de endomisio. Se observa una mayor disparidad entre los tamaños de las fibras

2) Patología neuromuscular con origen en el sistema nervioso periférico c. Patrón de atrofia neurógena: Gran cantidad de fibras normales a simple vista, aunque aparecen pequeños grupos sin patrón específico de células pequeñas. Puede afectar más a unos músculos que a otros.

Puede presentar selectividad en la afectación de fibras tipo I y tipo II, aunque no ocurre siempre. Pueden aparecer reinervaciones, lo cual elimina el mosaico. En casos muy avanzados, pueden aparecer principios de fibrosis.

Actualmente, la evaluación morfológica de las biopsias o secciones musculares para realizar el diagnóstico es realizada visualmente por médicos especialistas denominados patólogos. Es fácil apreciar que existe un elevado grado de subjetividad en estos diagnósticos basados en la interpretación visual de los patólogos, pudiendo aparecer diferencias en los diagnósticos en función del grado de formación, de la experiencia o de la pericia de cada patólogo. Además, actualmente los patólogos son capaces de determinar la presencia o ausencia de una determinada enfermedad y de estimar el grado de afectación o de evolución en el paciente, pero no pueden cuantificarlo.

Recientemente se ha descubierto la utilidad de aplicar la teoría de redes a la caracterización de la organización de los tejidos. La teoría de redes se ha utilizado ampliamente para analizar diversos tipos de procesos o sistemas biológicos complejos a diferentes escalas, desde interacciones entre moléculas hasta interacciones entre especies. Sin embargo, su aplicación a nivel de individuo o de grupos de células ha sido limitada hasta la publicación del artículo “Epithelial organisation revealed by a network of cellular contacts”, de Luis M. Escudero et al. (Escudero et al., 2011) . El método descrito en este artículo está basado en el análisis de las imágenes de tejidos la mosca Drosophila y de pollo, que están básicamente constituidas por simples células poligonales de diferentes tamaños según el tipo de epitelio. De este análisis se obtienen una serie de parámetros fundamentalmente basados en el tamaño, forma y conectividad de dichas células, construyéndose un vector característico de cada muestra. Se descubre entonces que el vector característico de cada muestra permite identificar cambios en el epitelio como consecuencia de la mutación de un gen, diferenciar entre tejidos de uno u otro organismo, e incluso identificar diferentes estados de crecimiento de un mismo organismo, todo ello de forma de forma automática y objetiva.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un método que aplica los recientes descubrimientos relacionados con la teoría de redes para obtener nuevos parámetros específicos capaces de caracterizar una biopsia de tejido músculo esquelético de un paciente. La comparación del vector característico correspondiente a la biopsia del paciente con el vector característico correspondiente a una biopsia control permitirá determinar de un modo objetivo la existencia de posibles enfermedades musculares. Es más, en función de la diferencia entre unos parámetros y otros, será posible incluso determinar el grado de afectación del paciente.

El método está desarrollado específicamente para el tejido músculo esquelético que, como se ha mencionado anteriormente, está formado por fibras musculares alargadas agrupadas en fascículos. Cada fibra se interpreta como un nodo de la red, mientras que los contactos entre fibras constituyen las uniones entre los nodos de la red. El método de la invención reconoce dos tipos de nodos según si la fibra muscular es de tipo I o de tipo II, y además tiene en cuenta el colágeno almacenado en forma de endomisio en las fronteras entre fibras.

Según un primer aspecto de la invención, el método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares a partir de una biopsia de tejido músculo esquelético comprende los siguientes pasos:

1) Realizar una tinción de la biopsia para resaltar las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio.

El objeto de la tinción es poder identificar visualmente en la muestra los dos tipos de fibras musculares (tipo I y tipo II) , así como el endomisio. En principio, se podría aplicar cualquier tipo de tinción capaz de conseguir este propósito, aunque preferentemente se aplican preparaciones de dos anticuerpos que tiñen de colores diferentes dos elementos de entre los tres mencionados. Es decir, se tiñen dos de ellos de colores diferentes, quedando el color del tercero sin modificar.

Más concretamente, en una realización preferida de la invención se aplica un primer anticuerpo que actúa contra la proteína colágeno VI para teñir el endomisio de un primer color (verde) y un segundo anticuerpo que actúa contra la cadena pesada de la isoforma lenta de la miosina (concretamente sMyHC) para teñir las fibras musculares tipo I de un segundo color (rojo) . Las fibras musculares tipo II, que no han sido teñidas, se mantienen de un color oscuro cercano al negro.

2) Obtener una imagen de la biopsia tras la tinción.

Para obtener la imagen se utiliza preferentemente un microscopio de fluorescencia, normalmente conectado a un ordenador. La imagen se obtiene de una zona de la biopsia carente de artefactos causados durante la preparación de la misma. El resultado es una imagen que contiene fundamentalmente un mosaico de fibras musculares de colores rojo (tipo I) y negro (tipo II) separadas por bandas de color verde (endomisio) .

3) Segmentar la imagen para identificar los contornos de las fibras musculares.

1. Método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares a partir de una biopsia de tejido músculo esquelético, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

- realizar una tinción de la biopsia para resaltar las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio;

- obtener una imagen de la biopsia tras la tinción;

-segmentar la imagen para identificar los contornos de las fibras musculares;

-formar una red donde las fibras musculares constituyen nodos y los contactos entre fibras musculares constituyen las uniones entre los nodos; y

- formar un vector característico de la biopsia cuyos elementos se eligen entre parámetros geométricos de las fibras y parámetros de red.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el paso de tinción de la muestra comprende aplicar preparaciones de dos anticuerpos que tiñen de colores diferentes dos elementos de entre: las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, donde un primer anticuerpo actúa contra la proteína colágeno VI para teñir el endomisio de un primer color y un segundo anticuerpo actúa contra la cadena pesada de la isoforma lenta de la miosina para teñir las fibras musculares tipo I de un segundo color.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el anticuerpo contra la cadena pesada de la isoforma lenta de la miosina es sMyHC.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

donde el paso de obtención de una imagen de la biopsia teñida se lleva a cabo utilizando un microscopio de fluorescencia en una zona de la biopsia carente de artefactos causados durante la preparación de la misma.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

donde el paso de segmentación comprende el cálculo de marcadores morfológicos para fibras musculares y la aplicación de la Transformada Watershed.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, donde el paso de formación de la red comprende identificar los vecinos de las fibras musculares mediante la expansión del contorno de cada fibra aplicando directamente la Transformada Watershed a los marcadores morfológicos para fibras musculares.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el paso de formación de la red comprende además representar gráficamente la biopsia como un grafo formado por nodos y uniones entre nodos, estando los nodos ubicados en el centro de masa de cada fibra.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los parámetros del vector característico se eligen entre los siguientes:

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los parámetros del vector característico se eligen utilizando los métodos SFS y SBS mediante una red neuronal Fuzzy-ARTMAP

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende comparar el vector característico con un vector característico control correspondiente o equivalente a una biopsia de tejido sano.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la comparación del

vector característico con el vector característico control se realiza utilizando la técnica de Análisis de la Componente Principal (ACP) .

13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12,

1 Área media de las fibras

2 Desviación típica del área de las fibras

3 Número medio de vecinos de cada fibra

4 Desviación típica del número de vecinos de cada fibra

5 Área media de las fibras tipo I

6 Desviación típica del área de las fibras tipo I

7 Área media de las fibras tipo II

8 Desviación típica del área de las fibras tipo II

9 Desviación típica del número de vecinos de las fibras tipo I

10 Desviación típica del número de vecinos de las fibras tipo II

11 Número medio de vecinos tipo I de las fibras tipo I

12 Número medio de vecinos tipo II de las fibras tipo I

13 Número medio de vecinos tipo I de las fibras tipo II

14 Número medio de vecinos tipo II de las fibras tipo II

15 Media del cociente A1/A2

16 Desviación típica del cociente A1/A2

17 Dimensión media del eje mayor de las fibras

18 Dimensión media del eje menor de las fibras

19 Media de la relación de ejes

20 Desviación típica de la relación de ejes

21 Media de la envoltura convexa

22 Desviación típica de la envoltura convexa

23 Ángulos medios

24 Desviación típica de los ángulos

25 Media cociente área fibra/ área media fibras vecinas

26 Desviación típica cociente área fibra/ área media fibras vecinas

donde un vector característico formado por los parámetros 19 (media de la relación de ejes) , 23 (ángulos medios) y 25 (media cociente área fibra/área media fibras vecinas) permite determinar la presencia y grado de afectación de distrofia muscular.

14. Programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Programa de ordenador según la reivindicación 14, incorporado en 15 medios de almacenamiento.

16. Programa de ordenador según la reivindicación 14, soportado en una señal portadora.

FIG. 1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5