Método para la obtención del perfil genético de un individuo mediante el análisis de loci de cromosoma x.

La presente invención se refiere a un método para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis,

en un extracto de ADN procedente de dicho individuo, mediante una reacción de amplificación multiplex, de al menos 4 loci STRs del grupo formado por los loci DXS6799, DXS 10074, DXS6789, DXS6809, DXS7132, DXS6801, DXS10075 y DXS10079, en donde a) al menos uno de los 4 loci STRs se selecciona del grupo formado por los loci DXS6799, DXS10074, DXS6789 y DXS6809, y b) al menos dos de los 4 loci STRs se selecciona del grupo formado por los loci DXS7132, DXS6801, DXS10075 y DXS10079. Asimismo, se contempla un kit para la realización de dicho método. Finalmente, la invención contempla el conjunto de parejas de cebadores, de secuencias SEQ ID NO I-SEQ ID NO 17, empleado para llevar a cabo el método de la presente invención.

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DEL PERFIL GENÉTICO DE UN INDIVIDUO MEDIANTE EL ANÁLISIS DE LOCI DE CROMOSOMA X

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis de 4 o más loci STRs, hasta un total de 8 loci, todos ellos localizados en el cromosoma X, en un extracto de ADN de dicho individuo meoiante una reacción de amplificación multiplexo Asimismo, la presente invención también se dirige a un kit que comprende las parejas de cebadores para la puesta en práctica del método de la invención. Tanto el método como el kit aquí descritos son de aplicación en la identificación de individuos en el área de la genética forense, así como en genética de poblaciones, antropología y biomedicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente la obtención de perfiles genéticos mediante el análisis de loci STRs (Short Tandem Repeats) autosómicos plantea en ocasiones problemas técnicos que se traducen en no poder ofertar un resultado concluyente de probabilidad de paternidad o parentesco que es solicitado por los Tribunales de Justicia. Ello acontece fundamentalmente en la determinación de casos complejos: la falta de algún progenitor o de ambos existiendo abuelos/tíos. En estos casos se hace necesario el análisis nuevamente de los individuos con otros kits de STRs de cromosomas autosómicos y STRs de cromosomas sexuales (STRs del cromosoma X y del Cromosoma Y) con el fin de aumentar el número de STRs analizados y alcanzar una probabilidad suficiente.

En numerosas ocasiones a 10 anteriormente expuesto se añade otra circunstancia que dificulta el análisis de individualización con los STRs convencionales y es la degradación del ADN de la muestra objeto de estudio.

Por todo lo anterior resulta prioritario desarrollar nuevas metodologías de obtención de perfiles genéticos alternativos a los ya existentes en el estado de la técnica y que superen los inconvenientes actuales.

El cromosoma X comprende 155 Mb Y representa el 5% del total del material genético de las células. Contiene aproximadamente del orden de 1100 genes. Tan solo un 1.7% de este cromosoma codifica proteínas funcionales, presentando un elevado contenido de ADN no codificante repetitivo (Ross et al., 2005 Nature 434: 325-337) . Parte de esta fracción son regiones cortas repetidas en tándem o "short tándem repeats" (STR) . Hasta la fecha, se han descrito más de cincuenta STRs en el cromosoma X cuyo análisis es fundamentalmente de interés entre otras, en Genética Forense y en las disciplinas anteriormente mencionadas (Gusmao et al., 2012 Methods Mol. Biol. 830: 57-71) .

El análisis de marcadores microsatélites denominados STRs (Short Tandem Repeats) es hoy en día la técnica de referencia para la obtención de perfiles genéticos destinados a identificación de individuos, determinación de parentesco o criminalística.

Sin embargo, la eficacia de los STR autosómicos se ve reducida en la resolución de determinados casos de parentesco, tales como aquellos en las que la muestra de alguno de los miembros familiares no está disponible y la descendencia es femenina (Szibor et al., 2007 Forensic Sci. lnt. Genet. 1 :93-97; Szibor et al., 2003 Int. J. Legal Med. 117: 67-74) .

En dichos casos, el análisis de STRs del cromosoma X constituye una herramienta complementaria de elevado interés (Zarrabeitia et al., 2002 Forensic Sci. lnt. 129 (2) :85-89; Szibor et al., 2003 Int. J. Legal Med. 117: 67-74; Liu et al., 2008 Int. J. Legal Med. 122: 261265) . Así mismo, ha demostrado gran utilidad en la identificación de individuos.

Herencia del cromosoma X

Ello se debe al particular modo de herencia del cromosoma X. Los hombres poseen un único cromosoma X y un único cromosoma Y, transmitiendo una copia exacta del Cromosoma X a todas sus hijas, tal como lo heredó de su madre y una copia exacta del cromosoma Y a todos sus hijos (Wakefield et al., 2006 Encyclopedia of life sciences; Burgoyne et al., 1982 Hum. Genet. 61: 85-90) .

Por lo que, el haplotipo del cromosoma X e Y paterno puede ser detectado respectivamente en la descendencia femenina y masculina.

Las mujeres por su parte, contienen dos cromosomas X. Trasmiten uno de ellos a cada descendiente independientemente del sexo. Este cromosoma X que trasmite la madre puede ser una copia exacta de cualquiera de sus cromosomas o puede haber sufrido una recombinación entre los dos cromosomas X y ser distinto de la copia inicial que posee la mujer (Wakefield et al., 2006 Encyclopedia oflife sciences) .

Teniendo en cuenta que los padres van a transmitir una copia entera del Cromosoma X en ausencia de recombinación a todos sus descendientes femeninos, podemos determinar su haplotipo directamente.

Aplicaciones del cromosoma X en diagnóstico de parentesco.

Esta característica del cromosoma X del varón permite estudios de paternidad de descendencia femenina, aún en ausencia del presunto padre constituyendo la principal ventaja del análisis de microsatélites del cromosoma X frente a sus homólogos autosómicos. El haplotipo del cromosoma X del padre será idéntico a uno de los cromosomas de la abuela paterna, por 10 que si al menos un alelo de cada marcador analizado de la abuela no coincide con el de la nieta podrá descartarse la paternidad biológica. Estos análisis presentan una elevada probabilidad de exclusión. A su vez, en aquellos casos en los que la abuela tampoco esté disponible, puede reconstruirse su genotipo a través del estudio de los hermanos/as del presunto padre (Szibor et al., 2007 Forensic Sci. lnt: Genet. 1 :93-97; Szibor et al., 2003 Int. J. Legal Med. 117: 67-74) . De un modo general, puede afirmarse que el estudio de STRs del cromosoma X de hermanos revela gran parte del genotipo materno (Szibor et al., 2003 lnt. Congr. Ser. 1239: 815-820) .

Por 10 tanto, el análisis del cromosoma X también es de utilidad en el estudio de parentescos más distantes como el previamente mencionado abuela-nieta (Liu et al., 2008 Int. J. Legal Med. 122: 261-265) , e incluso en el estudio de grandes pedigríes familiares siempre que en cada generación exista al menos un descendiente femenino. La potencia de su análisis en este sentido, reside en la existencia de loci que por su proximidad física y sus características específicas constituyen bloques haplotípicos que se heredan juntos y se mantienen estables a través de las generaciones (Szibor et al., 2003 Int. Congr. Ser. 1239: 815-820) .

Por otro lado, el análisis de STRs del cromosoma X es de gran interés en el estudio de presuntas hermanas o medio-hermanas por parte de padre. Estas deberán compartir un alelo de cada marcador del cromosoma X estudiado, que provienen del padre (Zarrabeitia et al., 2002 Forensic Sci. Int. 129: 85-89; Liu et al. Int. J. Legal Med. 122:261-265; Zarrabeitia et al., 2006 Int. J. Legal Med. 120:147-150; Gomes et al., 2008 Int. J. Legal Med. 123 (2) :143149; Zarrabeitia et al., 2007 Int. J. Legal Med. 121: 433-437; Becker et al., 2008 Forensic Sci. Int. Genet. 2 (1) :69-74) .

En el caso particular de incestos padre-hija, los micro satélites del cromosoma X complementan el análisis de STR autosómicos, ya que si la hija se queda embarazada, en su descendencia femenina no existirá ningún alelo distinto a los presentes en dicha progenitora. Su utilidad destacaría en cuanto a excluir un supuesto incesto. Mientras que debido a las limitaciones de inclusión de los STRs del cromosoma X, es necesario considerar que el haplotipo del cromosoma X puede ser compartido por otros miembros de la misma familia (Szibor et al., 2007 Forensic Sci. Int: Genet. 1 :93-97; Szibor et al., 2003 Int. J. Legal Med.

117: 67-74) .

Aplicación del cromosoma X en identificación.

En lo que se refiere al análisis de indicios biológicos, los estudios de microsatélites del Cromosoma X, resultan especialmente útiles en la identificación de un perfil femenino en una evidencia que contenga una mezcla de ADN masculino y femenino. En este caso, los alelos de la muestra femenina pueden ser completamente enmascarados por los alelos de la muestra masculina, solamente si la mujer es homocigótica y coincidente en todos los loci con el hombre, suceso muy poco probable. Por lo que, dichos análisis resultan de utilidad en la resolución de casos criminales en los que pongamos como ejemplo, sea necesaria la demostración de la presencia de células epiteliales ó vaginales femeninas, en el cuerpo del supuesto agresor o en objetos con los que esté haya estado en contacto.

Creciente desarrollo de reacciones para el análisis de STRs del cromosoma X Debido a las aplicaciones descritas en los epígrafes anteriores, el desarrollo...

1) Un método para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis, en un extracto de ADN procedente de dicho individuo mediante una reacción de amplificación multiplex, de la combinación de 8 loci STRs del cromosoma X constituidos por DXS6799, DXSlO074, DXS6789, DXS6809, DXS7132, DXS6801, DXSlO075 y DXSlO079.

2) Método según la reivindicación 1 donde la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación multiplex específica para cada uno de los 8 loci STR analizados es la pareja de oligonucleótidos mostrada en las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para ellocus DXS6799, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para ellocus DXS 1 0074, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para ellocus DXS6789, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para ellocus DXS6809, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para ellocus DXS7132, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para ellocus DXS6801, SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 15 para ellocus DXS10075, y SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para ellocus DXSlO079.

3) Método según la reivindicación 2, en donde la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 17 está comprendida entre 57, 5 y 63 oC.

4) Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.

5) Método según las reivindicación 4, en donde los compuestos empleados en el marcaje de los oligonuc1eótidos se seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.

6) Método según la reivindicación 5, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-F AM) , 6-F AM, análogo tetrac1ºrinado de t-F AM (TET) , análogo hexac1ºrinado de 6-F AM (HEX) , 6carboxitetrametilrodamina (TAMRA) , 6-carboxi-X-rodamina (ROX) , 6-carboxi-4', 5'dic1ºro-2', T-dimetoxifluoresceína (lOE) , NED O, Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC) .

7) Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el extracto de ADN procede de una muestra de sangre, pelo, saliva, epidermis, esperma, caspa, cenizas, una muestra vaginal o una muestra de tejido.

8) Un kit, para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1-7, que comprende parejas de cebadores específicas para amplificar en una única reacción multiplex los 8 loci STRs DXS6799, DXS10074, DXS6789, DXS6809, DXS7132, DXS6801, DXS10075 y DXS10079.

9) Kit según la reivindicación 8, en donde la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación multiplex específica para cada uno de los 8 loci STR analizados es la pareja de oligonuc1eótidos mostrada en las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para ellocus DXS6799, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para ellocus DXSI0074, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para ellocus DXS6789, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para ellocus DXS6809, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para ellocus DXS7132, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para ellocus DXS6801, SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO 14 y/o SEQ ID NO: 15 para el locus DXSlO075, y SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para ellocus DXSI0079.

10) Kit según la reivindicación 8 ó 9, en el que la pareja de cebadores comprende un oligonucleótido marcado en uno de sus extremos.

11) Kit según la reivindicación 8 ó 9 que comprende adicionalmente los reactivos necesarios para marcar las parejas de cebadores.

12) Kit según la reivindicación 11, en donde los reactivos empleados para marcar las parejas de cebadores se seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.

13) Kit según la reivindicación 12, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-F AM) , 6-F AM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET) , análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX) , 6carboxitetrametilrodamina (TAMRA) , 6-carboxi-X-rodamina (ROX) , 6-carboxi-4', 5'dicloro-2'.

7. dimetoxifluoresceína (lOE) , NED 0, Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC) .

14) Conjunto de parejas de cebadores que comprende, 8 parejas de cebadores dirigidas a amplificar en una reacción multiplexlos 8 loci STRs DXS6799, DXSlO074, DXS6789, DXS6809, DXS7132, DXS6801, DXSlO075 y DXSlO079.

15) Conjunto, según la reivindicación 14, donde las parejas de cebadores son las siguientes: SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para ellocus DXS6799, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para ellocus DXSI0074, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para ellocus DXS6789, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para ellocus DXS6809, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para ellocus DXS7132,

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para ellocus DXS6801, SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 15 para el locus DXSI0075, y SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para ellocus DXSI0079.

16) Uso de un conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 14 ó 15 para obtener el perfil genético de un individuo, para identificar un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

filo -.. PonoI sao A:U¡23-X mím~rrR7-13-11..a·25 A3923-Xm~TR mimSTRaX

, ..

oL___~""--t..._""""Ó"_J'_-i\___---'-____

, ___----.J

l'

Ju.t Alelo JI I;J AI;to l;¡~ :

jsz.113.1{, IS/16:!.OK !n 15'

lhl 18?7 :ht 74~ 83

'tI.

4. ;'

FIGURA 1 100 150 200 220 FLUORESCENT OYE

OXS6799

DXS6789

DXS10075 DXS10079 PE~

FIGURA 2

FIGURA 3 FIGURA 4

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>

<120>

<130>

<160>

<170>

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

UNIVERSIDAD DE CANTABRIA

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN MEDIANTE EL ANÁLISIS DE UC 2012-002 17 PatentIn vers;on 3.3 1

DNA Art; f; c; al

DEL PERFIL GENÉTICO DE UN INDIVIDUO LOCI DE CROMOSOMA X

cebado.

5. 3' para el locus Dxs6799 1

actagcaaac tgaatttagt aatgtg

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

DNA

Art; fi c; al

cebado.

5. 3' para el locus Dxs6799

taactacttg cacatgggat 9

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> cebado.

5. 3'

<400> 3 tacatggact tcctactgc

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebado.

5. 3'

<400> 4 para el locus Dxs10074

para el locus Dxs10074

atactgaata taagctgatt tgttcta <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

DNA

Arti fi ci al

cebado.

5. 3' para el locus Dxs6789

<400> 5 aagttggtac ttaataaacc ctc 23

<210> <211> <212> <213> 6 22 DNA Artificial

<220> <223> cebado.

5. 3' para el locus Dxs6789

<400> 6 agaaccaata ggagatagat gg 22

<210> <211> <212> <213> 7 26 DNA Arti fi ci al

<220> <223> cebado.

5. 3' para el locus DXS6809

<400> 7 catgactaga ttatgtagga atttgg 26

<210> <211> <212> <213> 8 20 DNA Arti fi ci al

<220> <223> cebado.

5. 3' para el locus Dxs6809

<400> 8 tgtgaggaag agatagagga 20

<210> <211> <212> <213> 9 20 DNA Arti fi ci al

<220> <223> cebado.

5. 3' para el locus DXS7132

<400> 9 ccctctcatc tatctgactg 20

<210> <211> <212> <213> 10 21 DNA Arti fi ci al

<220> <223> cebado.

5. 3' para el locus DXS7132

<400> 10 ctctattagt caacgttctc c 21

<210> <211> <212> 11 23 DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> cebao.

5. 3' para el

<400> 11 cataatcaca tgagtcattt cct

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebado.

5. 3' para el

<400> 12

atctgtatta gttatgagtt tccag

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> cebado.

5. 3' para el

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebado.

5. 3' para el

<400> 14

agatattgca gagaagaatc atatc

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebado.

5. 3' para el

<400> 15

gactacctct gctccctt

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> cebado.

5. 3' para el

<400> 16 gtgaccaagt gagaccaa locus Dxs6801

<400> agttattgca gagaagaatc atatc

locus Dxs6801

25

locus DXS10075

25

locus DXS10075

25

locus DXS10075

18

locus DXS10079

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebado.

5. 3' para el locus DXS10079

<400> 17 ttgttgagaa cttttgcatc a