Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

METODO PARA LA OBTENCION DE CULTIVARES DE TOMATE CON FRUTOS PARTENOCARPICOS (SIN SEMILLAS) Y MAYOR CALIDAD ORGANOLEPTICA.

Patente de Invención. Resumen:

El método se basa en la transferencia y expresión del gen LFY de Arabidopsis thaliana en plantas transgénicas de tomate. Los frutos de las plantas transgénicas con el gen LFY mantienen el mismo tamaño y peso que los del cultivar original, pero carecen de semillas, tienen más carne, menos pulpa y una forma ligeramente apuntillada. El análisis de calidad refleja un incremento del 60 % en el contenido en sólidos solubles

(la media alcanza 6,12 ºBrix) y del 60 % en ácidos valorables (la media llega al 0,72 %), lo que indica una mejora de la calidad organoléptica de los frutos en comparación con los del cultivar original no transgénico. Además, los frutos de las plantas transgénicas tienen otros atributos que indican una mayor calidad, tales como un mayor contenido en azúcares (sobre todo glucosa y fructosa) y licopeno, una sustancia que tiene propiedades antioxidantes.

Solicitante: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACION Y TECNOLOGIA AGRARIA Y ALIMENTARIA
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC)
UNIVERSIDAD DE ALMERIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: VALENCIA.

Fecha de Solicitud: 23 de Junio de 2005.

Fecha de Publicación de la Concesión: 8 de Julio de 2010.

Fecha de Concesión: 22 de Junio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: A01H5/08 (.Frutos), C12N15/82A4B.

Clasificación PCT: C12N15/82 (....para células vegetales [5]), A01H5/08 (.Frutos).

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Descripción:

Método para la obtención de cultivares de tomate con frutos partenocárpicos (sin semillas) y mayor calidad organoléptica.

Área de aplicación

La presente invención describe la obtención de plantas de tomate con frutos partenocárpicos (sin pepitas o semillas) mediante transferencia y expresión del gen LFY de Arabidopsis thaliana. Además de la ausencia de semillas, los frutos de estas plantas muestran un incremento de la calidad (debido a un aumento de sólidos solubles, acidez, mayor contenido en glucosa y fructosa y mayor concentración de licopeno) y mantienen el peso medio característico del cultivar original (p73) no transgénico.

Estado de la técnica

Mejora del sabor de los frutos de tomate

El sabor de los frutos del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) es un carácter complejo que guarda una relación directa con su composición química. El incremento en el contenido en sólidos solubles totales (SST) y en ácidos valorables suele estar correlacionado con el incremento de sabor (Saimbhi et al., 1995).

Gracias a la mejora tradicional, por cruzamientos entre parentales y selección de la descendencia, los cultivares modernos de tomate son híbridos adaptados a las cadenas de producción-consumo que producen frutos de buena apariencia (calibre, coloración) y larga vida post-cosecha (LSL). Sin embargo, la obtención de variedades con estas características se ha realizado sacrificando la calidad organoléptica o sensorial de los frutos (Diez & Nuez, 1995). Por ello, la recuperación de los atributos de calidad constituye hoy en día uno de los objetivos prioritarios en la mejora genética del tomate.

La mejora tradicional ha tenido un éxito muy limitado en este sentido debido a la relación negativa entre producción y contenido en sólidos solubles (Stevens 1979, 1986). La utilización de germoplasma de especies silvestres relacionadas, principalmente de Lycopersicon chmielewskii y L. cheesmanii, parece esperanzadora (Nuez, 1995). A partir de híbridos entre L. esculentum y estas especies silvestres, se han derivado líneas con un alto contenido en sólidos solubles (Risck, 1974; Hewitt & Garvey, 1987, Poysa, 1993) que se están utilizando actualmente en programas de mejora. Sin embargo, la naturaleza compleja del carácter y el ligamiento de algunos de los genes que lo controlan el contenido en SST con otros que determinan caracteres agronómicamente indeseables (eg. baja producción o reducción del calibre del fruto) dificulta notablemente su manejo en los programas de mejora (Ibarbia & Lambeth, 1969; Tanksley & Hewitt, 1988; Paterson et al., 1988; 1991; Goldman et al., 1995).

Obtención de frutos partenocárpicos

Unos de los objetivos más relevantes en la mejora del tomate es la obtención de frutos partenocárpicos, es decir frutos sin semillas. En tomate, la formación de frutos sin semillas se puede conseguir artificialmente (Bangerth & Sjuit, 1978) y suele ser una práctica habitual. Se logra mediante aplicación de auxinas como el ácido 4-clorofenoxiacético (4CPA) o el ácido 2-hidroximetil-4-clorofenoxiacético (HCPA) a los racimos florales de tomate. Sin embargo, los frutos partenocárpicos obtenidos por este método son de pobre calidad debido al escaso desarrollo de la pulpa y a una carne esponjosa insípida.

La segunda posibilidad consiste en aprovechar la partenocarpia natural debida a causas genéticas, que puede ser obligatoria o facultativa, es decir dependiente de las condiciones ambientales o de la interacción entre las condiciones ambientales y el genotipo (Ho & Hewitt, 1986). Se han descrito dos cultivares ("Severianin" y "RP75/59") como posibles fuentes de variación para aprovechar la partenocarpia facultativa (Maisonneuve, 1978). Mediante mejora tradicional se han conseguido tres cultivares partenocárpicos derivados de "Severianin": "Freda" (Costa et al., 1992), "Oregon Star" y "Oregon Pride" (Bagget et al., 1995). En estos casos, el mayor inconveniente es la dependencia que muestran estos cultivares de condiciones subóptimas para respuestas como son la formación de polen, la polinización o la fecundación, como pueden ser las temperaturas bajas (Mohamed, 1998). Factores tan variables como la duración del día, la intensidad y la calidad de la luz y las interacciones entre temperatura y luz pueden jugar un papel clave en dichas respuestas y limitar la producción de frutos sin semillas.

Para explicar la partenocarpia en "Severianin" se ha propuesto un modelo genético sencillo, según el cual el carácter estaría controlado por un simple gen, denominado pat-2 (Lin, 1982; Lin et al., 1984; Catalá y Nuez, 1990). Otros autores sugieren la intervención de un segundo gen (mp) presente en los genotipos no partenocárpicos y que podría influir en homocigosis sobre la expresión de pat-2 (Vardy et al., 1989). En el caso de la línea "RP 75/59" dos genes recesivos (distintos a pat-2 y mp) determinan la expresión de este carácter (Catalá & Nuez, 1990). La clonación y caracterización del gen pat-2 permitirían estudiar las bases moleculares del proceso de formación de un fruto partenocárpico (Fos & Nuez, 1992), pero hasta la fecha esto no ha sido factible.

Otra alternativa para inducir partenocarpia se basa en la ingeniería genética. Rotino et al., (1997) introducen en tabaco y berenjena, el gen iaaH (aislado de Pseudomonas syringae pv. savatanoi) bajo control de una secuencia reguladora específica de óvulos de Antirrhinum majus (DefH9). De esta forma se induce la síntesis de ácido indol-3-acético (AIA) durante las fases iniciales y el desarrollo del ovario, lo que conduce a la obtención de frutos partenocárpicos en estas dos especies. Sin embargo, la obtención de frutos sin semillas requiere la castración previa de las flores y, además, los autores no comentan ninguna mejora de la calidad de los frutos. En teoría, teniendo en cuenta que el efecto del transgén iaaH se basa en el mismo principio que la inducción artificial de partenocarpia, cabe pensar que, en tomate, los frutos partenocárpicos con un nivel excesivo de auxinas endógenas mostrarían una baja calidad, al igual que ocurre en el caso de los frutos sin semillas obtenidos mediante tratamiento con auxinas exógenas.

De hecho, las plantas transgénicas de tomate cv UC82 con la construcción DefH9-iaaM producen frutos malformados (Pandolfini et al, 2002). Para evitar este problema, los autores no han tenido más remedio que modular la expresión del gen introduciendo una secuencia corriente arriba que, aparentemente, limita su expresión. Con esta nueva construcción (DefH9RI-iaaM) los capullos florales de las plantas transgénicas tienen un nivel de auxina endógeno 10 veces superior al de los controles, pero 5 veces menor que el de las plantas transfolinadas con la construcción original (DefH9-iaaM). Lo interesante de este trabajo es que las plantas transgénicas de tomate con esta nueva construcción (DefH9RI-iaaM) producen frutos partenocárpicos con una morfología aparentemente normal (Pandolfini et al, 2002). A pesar de ello, con la excepción de la partenocarpia, los frutos no tienen otros atributos que indiquen una mayor calidad con respecto a los del cultivar original.

Descripción de la invención

Teniendo en cuenta la problemática anterior, en la presente invención se describe un método que permite:

•vtcortaunaLa obtención de frutos de tomate partenocárpicos (sin semillas) •vtcortaunaUna mejora de la calidad de los frutos debido a: BoxvtcortaunaMayor contenido en sólidos solubles y ácidos valorables BoxvtcortaunaMayor contenido en azúcares (principalmente glucosa y fructosa) BoxvtcortaunaMayor contenido en licopeno, una sustancia con propiedades antioxidantes •vtcortaunaConseguir los atributos anteriores, sin que por ello quede alterado el peso medio del fruto del cultivar original y la producción total por planta.

Descripción detallada de la invención

En plantas transgénicas de tomate con el gen LFY hemos observado un acortamiento de la fase juvenil vegetativa. Este adelanto de la floración mediante iniciación floral en meristemos vegetativos ha sido previamente descrito en plantas transgénicas de Arabidopsis (Weigel & Nilsson, 1995; Mandel & Yanofsky, 1995), tabaco (Nilsson & Weigel, 1997), álamo (Rottmann et al., 2000), arroz (He et al., 2000) y citrange Carrizo (Peña et al., 2001) que expresan el mismo gen LFY. De hecho, en 1997, D. Weigel protege una invención basada en la obtención de "Plantas geneticamente modificadas con una modulación en el desarrolllo de los meristemos florales". En la mencionada patente, el autor describe la precocidad del desarrolllo floral en plantas de tabaco que sobreexpresan el gen LFY de Arabidopsis (U.S. Patent Number 5,637,785; Jun. 10, 1997).

Modificación del patrón de crecimiento

Una característica distintiva y relevante que presentan las plantas transgénicas de tomate con el gen LFY es que los brotes axilares crecen hasta aproximadamente la misma distancia del centro de la planta. Esto confiere un porte más compacto a las plantas transgénicas p35S::LFY de tomate, muy similar al que tienen las plantas de crecimiento determinado de esta misma especie. Por lo tanto podemos concluir que, mediante la expresión del gen LFY, se puede modificar el tipo de crecimiento del tomate: un cultivar de tipo indeterminado (como p73) se puede convertir así en un cultivar de crecimiento determinado (eg. UC82b). Estas plantas no necesitan entutorado ni poda lo que abarata los costes de producción.

La conversión de un patrón de crecimiento indeterminado a determinado se ha conseguido previamente mediante métodos clásicos de mejora introduciendo el gen recesivo sp (selfpruning o "autopoda") en cultivares de crecimiento indeterminado. Sin embargo, la introducción del gen sp por mejora tradicional implica un programa de retrocruzamientos que supone varios años de trabajo. Mediante la expresión del gen LFY por ingeniería genética en plantas transgénicas de tomate se puede conseguir el mismo resultado en un periodo sensiblemente menor (menos de un año).

Obtención de frutos de tomate partenocárpicos

La expresión de LFY no afecta al desarrollo de las flores. Las plantas transgénicas presentan un número de órganos florales similar al de las plantas testigo. Hemos comprobado también la fertilidad del polen de las plantas transgénicas p35S::LFY mediante germinación in vitro y se ha conseguido descendencia mediante cruzamiento entre transformantes primarios y plantas de la población original p73.

Un aspecto clave de la presente invención es la ausencia de semillas en los frutos de la plantas transgénicas. Es la primera vez que se describe la obtención de frutos partenocárpicos en una planta hortícola mediante la expresión de un gen implicado en la identificación de los meristemos florales.

A nivel agronómico, esta invención tiene varias ventajas con respecto a otros métodos para la obtención de frutos partenocárpicos de tomate.

sqbulletvtcortaunaLa inducción artificial de partenocarpia mediante el empleo de reguladores de crecimiento conduce a frutos insípidos y de tipo esponjoso, debido al escaso desarrollo de la pulpa. En cambio, los frutos partenocárpicos de las plantas transgénicas con LFY no sólo mantienen calidad de los originales sino que incluso la mejoran. sqbulletvtcortaunaRespeto a los métodos tradicionales de mejora que se basan en el aprovechamiento de la expresión natural de partenocarpia, la ventaja de nuestra invención es que la expresión del transgén LFY se verifica durante todo el desarrollo de la planta y es independiente de factores externos ambientales. sqbulletvtcortaunaLa obtención de frutos partenocárpicos mediante la expresión de genes que conducen a la biosíntesis de auxinas endógenas a lo largo del desarrollo de los frutos (Rotino et al., 1997) es una forma alternativa a la inducción artificial de partenocarpia mediante tratamiento exógeno con reguladores de crecimiento. Las plantas transgénicas de tomate con la construcción DefH9-iaaM producen frutos partenocárpicos, pero tienen diversas malformaciones (Pandolfini et al. 2002). El empleo de una construcción modificada (DefH9-RI-iaaM) permite obviar el problema anterior, pero los frutos no son de mejor calidad (Pandolfini et al. 2002). Con la estrategia que nosotros presentamos, los frutos partenocárpicos tienen, incluso, una mayor calidad que los del cultivar original.

Mejora de la calidad de los frutos

Aumento en el contenido de sólidos solubles. El incremento de un 60% de los grados Brix es de gran relevancia en la mejora del tomate ya que los métodos convencionales de mejora permiten unos incrementos mucho más limitados. Si consideramos que p73 es un cultivar con frutos de baja calidad organoléptica (la media está en torno a 3,7 ºBrix), el aumento conseguido en las plantas transgénicas (6.1 ºBrix de media) es espectacular. La determinación de ºBrix se realiza midiendo el índice de refracción (IR) con un refractómetro (Refractómetro de mano ATAGO N-14), el cual compara la velocidad de la luz que pasa a través de un líquido, con la velocidad a la cual pasa a través del aire.

El agua, por ejemplo, tiene un IR de 1.3330, lo que significa que el recorrido de la luz a través del agua es 1.3 veces más lenta que a través del aire.

En este experimento, hemos analizado los ºBrix de frutos plantas testigo y transgénicas 35S::LFY. La determinación se ha realizado en varios frutos de cada planta.

El método consiste en pelar cada fruto, triturarlo y filtrar el triturado con una gasa, de tal forma que sólo recogemos la fase líquida. A continuación colocamos una gota de agua que actuará como testigo (o blanco) y, posteriormente, añadimos una gota del filtrado de tomate. La unidad de dichas medidas serán los ºBrix.

Hay una relación directa entre el contenido total de sólidos solubles, mayoritariamente azucares, de la solución analizada (filtrado de tomate) y el IR de aquella solución. La unidad de dichas medidas serán los grados Brix, equivalentes al porcentaje en sólidos solubles, responsables en parte de la calidad organoléptica del fruto. En general los ºBrix del tomate cultivado oscilan entre 3,5 y 5.

Si este aumento fuera del mismo orden en plantas transgénicas de otros cultivares de tomate con mayor contenido en sólidos solubles totales (existen cultivares comerciales con medias en torno a los 5 - 5,5 ºBrix) se podría llegar a unos valores en tomo a 8-8,5 ºBrix que sólo se alcanzan en los frutos de las especies silvestres de Lycopersicon (sin valor comercial) o en algunas líneas de L. esculentum (e.g. UPV-3799; Roselló et al., 1999) que, a pesar de su alto contenido en sólidos solubles, tienen un fruto de tamaño pequeño (en torno a los 30 g).

•vtcortaunaAumento en el contenido de ácidos valorables. Aunque los frutos partenocárpicos obtenidos mediante la mejora tradicional pueden alcanzar un alto contenido en sólidos solubles y azúcares, tienen menos acidez que los frutos con semillas. quadLa anterior desventaja no ocurre en el caso de los frutos de plantas transgénicas 35S::LFY, ya que el aumento del contenido en sólidos solubles se ve acompañado por un incremento del porcentaje de ácidos solubles (en torno al 60%). quadConviene resaltar que el contenido en ácidos solubles está también relacionado con el incremento de sabor y que, de hecho, el índice de madurez (SST/acidez total) se ha utilizado frecuentemente como un índice de sabor (Bisogni et al., 1976). quadLa determinación de los ácidos valorables, se realiza, como su nombre indica, mediante la medida de la acidez del filtrado del fruto de tomate por valoración ácido-básica. El método consiste en añadir unas 3-4 gotas de fenolftaleina (un indicador de pH) en una solución de 5 ml de filtrado de tomate + 15 ml de agua destilada. En nuestro caso, la solución de filtrado de tomate diluido con fenolftaleina será incolora por ser ácida. A continuación se añade progresivamente NaOH 0,1 N (utilizando una bureta), hasta el momento que la solución vire de transparente a rosa. quadPosteriormente, medimos el volumen final de NaOH utilizado y calculamos el porcentaje de ácidos aplicando la siguiente formula

Z = V x N x mEqwt/Y x 100

quadZ: % de ácidos valorables en la muestra quadV: volumen gastado de NaOH 0,1 N quadN: normalidad de NaOH (0,1 N) quadmEqwt: miliequivalentes de ácido cítrico (0,064) quadY: volumen de muestra en ml (5 mL) quadEn general el porcentaje de ácidos valorables en frutos de tomate tras la recolección se encuentra en tomo al 0,5%. •vtcortaunaAumento en el contenido de azúcares. Los frutos de las plantas transgénicas con el gen LFY tienen un contenido dos veces mayor en glucosa y fructosa que los frutos de las plantas testigo. •vtcortaunaAumento en el contenido de licopeno. El licopeno es una sustancia que tiene propiedades antioxidantes. Los frutos de las plantas transgénicas tienen un mayor contenido en licopeno que los de las plantas de la población original.

Dominancia

La expresión de los nuevos caracteres (partenocarpia y componentes de calidad de los frutos) es de tipo dominante, ya que se verifica en las plantas transgénicas con el gen LFY en las que se ha generado un nuevo locus génico que está en situación de hemicigosis. Es decir, no hace falta fijar el gen en homocigosis para que aparezca el fenotipo. Esto representa una ventaja adicional con respecto a otros sistemas anteriormente mencionados (por ejemplo, los que se basan en la obtención de frutos partenocárpicos mediante la introducción de genes recesivos).

Mantenimiento del peso medio del fruto

Por encima de cualquier otra consideración, una variedad mejorada para un carácter dado debe mantener su rendimiento o producción original. Teniendo en cuenta que, en general, los frutos partenocárpicos tienen un peso fresco que es la mitad o las dos terceras partes del de los frutos con semillas (Philouze, 1983), no se puede garantizar una producción de frutos partenocárpicos de buen rendimiento por los métodos tradicionales (Ho & Hewitt, 1986). En cambio, mediante la expresión del gen LFY en tomate se mantiene el peso medio del fruto (en tomo a los 90 g) característico del cultivar p73 (Tabla 1).

Consideraciones adicionales

sqbulletvtcortaunaLa expresión constitutiva del gen LFY en plantas transgénicas de tomate conduce a dos tipos de efectos favorables: i) el cambio de arquitectura de la planta (de un crecimiento indeterminado se pasa a otro de tipo determinado); y ii) la formación de frutos partenocárpicos y con mayor calidad. Estos dos aspectos (cambio en la arquitectura de la planta, por un lado, y partenocarpia y calidad de los frutos, por otro) pueden conseguirse de forma separada transfiriendo el gen LFY bajo el control de promotores específicos (eg. la transformación con LFY bajo el control de un promotor específico de óvulos conduciría a frutos partenocárpicos y de mayor calidad sin que quede alterada la arquitectura de la planta). sqbulletvtcortaunaLa invención aquí descrita es, en principio, independiente del genotipo. Cuando se introduce partenocarpia mediante la mejora tradicional, la reacción puede ser mejor en frutos grandes de tipo multilocular que en frutos pequeños con pocos lóculos (Ho & Hewitt, 1986). En cambio, la disponibilidad de métodos de transformación con otros cultivares de tomate permite introducir el gen LFY en cualquiera de ellos con el fin de lograr la partenocarpia en frutos de distintas formas y tamaños, tanto para el consumo en fresco como para la industria. sqbulletvtcortaunaLa expresión del gen LFY puede tener el mismo efecto en otras especies (eg. sandía) en las que resulta relevante la obtención de frutos sin semillas y con mayor calidad organoléptica. Por tanto, el presente método debe extenderse a cualquier otra especie en la que se produzcan los efectos favorables descritos.

Las plantas transgénicas obtenidas no producen semillas viables -de hecho uno de los aspectos claves del método es que permite la obtención de frutos partenocárpicos (sin semillas) -y, por lo tanto, no pueden autofecundarse ni reproducirse entre ellas y dar una progenie transgénica. No se produce ni se reivindica por consiguiente variedad alguna.

Ejemplo 1

Obtención de plantas transgénicas de tomate con distintos niveles de expresión del transgén LFY

Teniendo en cuenta que la expresión de un gen implicado en el desarrollo floral podía afectar a caracteres del fruto y la arquitectura de la planta, elegimos el cultivar de tomate p73, no transgénico y de crecimiento indeterminado, como material vegetal de partida.

La transformación genética se llevó a cabo mediante un protocolo desarrollado por nosotros (Ellul et al., 2001) que implica el cocultivo de explantes con Agrobacterium tumefaciens. En un vector de tipo pBIN 19 (Bevan, 1983), el gen LFY se puso bajo el control del promotor constitutivo p35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV; Brisson et al., Nature, 310: 511, 1984). La construcción génica incluye también un gen marcador de resistencia a kanamicina (nptII) bajo control del promotor de la nopalina sintetasa (nos).

De los 60 transformantes primarios (TG1) se identificaron 30 plantas transgénicas diploides mediante citometria de flujo. Estas plantas se caracterizaron a nivel molecular mediante amplificación del DNA genómico por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el gen marcador de selección (nptII) y para el gen LFY. Además, se realizaron los análisis moleculares pertinentes con el fin de detectar el número de copias insertadas (análisis Southern) y el nivel de expresión de los transgenes (análisis Northern) en plantas diploides resistentes a la kanamicina y PCR positivas.

Ejemplo 2

Modificación del patrón de crecimiento

Con el fin de estudiar el efecto del transgén LFY sobre el patrón de crecimiento se cultivaron plantas de la población original (p73), somaclones de p73 (plantas no transgénicas regeneradas en las mismas condiciones) y plantas transgénicas (TG1) que expresan el gen LFY a distintos niveles transcripcionales.

En las plantas testigo (p73) pudimos observar un crecimiento de tipo simpodial, característico del tomate. La primera etapa consta de una fase juvenil vegetativa en la que aparecen entre 10 y 11 fitómeros (Figs. 1 y 4). En este momento, el meristemo del tallo principal (SAM = Shoot Apical Meristem) experimenta la transición a un meristemo de inflorescencia o floral. En cambio, las plantas transgénicas sólo forman 3-4 fitómeros antes de producir la primera inflorescencia (Figs. 1 y 2). Este adelanto de la floración a nivel ontogénico se traduce también en un incremento de la frecuencia de plantas transgénicas que se determinan: 20%, 50% y 80% a las 8, 13 y 18 semanas de cultivo, respectivamente, en contraste con lo que ocurre en las plantas testigo (0%, 30% y 35% para los mismos periodos de cultivo) (Fig. 2). Una de las consecuencias de esta determinación precoz es la reducción de la altura de las plantas transgénicas que sólo alcanzan unos 80 cm cuando las testigo superan los 160 cm (Fig. 3).

Tras la aparición de esta primera inflorescencia, el desarrollo del tallo principal continúa mediante la elongación de un brote axilar, que de nuevo se determina para que un nuevo brote axilar forme la siguiente unidad simpodial, y así sucesivamente. Este patrón de crecimiento se reproducirá dando lugar a un tallo compuesto de varias unidades simpodiales constituidas por 2 o 3 fitómeros en la planta testigo. En cambio, en las plantas transgénicas lo que se observa es una reducción en el número de fitómeros (entre 1 y 2) en las siguientes unidades simpodiales (Figs. 1 y 2). Además, en el caso de ciertos genotipos, la expresión de LFY promueve la iniciación y el desarrollo floral en los meristemos vegetativos de los brotes axilares.

Ejemplo 3

Obtención de frutos de tomate p35S::LFY partenocárpicos

Los frutos del cultivar p73 son ligeramente achatados, aunque los hay también más redondos (Figs. 5 y 6). Son frutos de gran tamaño (calibre G y GG; > a 67 mm), multiloculares (media en torno a 4 lóculos) y presentan unos hombros de intensidad ligera es decir, son del tipo acostillado ligero o liso. Todos los frutos tienen semillas.

En las plantas p35S::LFY, la mayoría de los frutos (80%) muestra una forma distinta a la del testigo: son apuntillados (forma de corazón), tienen más carne y menos pulpa y, además, son partenocárpicos (Figs. 5 y 6). Algunos (15%) son ligeramente achatados y sin semillas. Los restantes (5%) son frutos ligeramente achatados con unas pocas semillas (entre 10-20) por fruto.

En ninguna de las plantas transgénicas de tomate de los cuatro genotipos seleccionados (9.la, 37.2a, 42.1a y 45.3a) hemos podido observar semillas verdaderas (es decir, semillas con desarrollo normal, tamaño típico y viables). En el caso de las plantas transgénicas 35S::LFY de genotipo 37.2a y 42.1a, todos los frutos muestran una forma apuntillada que se acompaña con una ausencia absoluta de semillas. Sólo aparecen los embriones abortados (visibles en la Fig. 6). En cambio, en los genotipos 9.1a y 45.3a, el 12% y 44% de los frutos, respectivamente, muestran una forma achatada y las mismas semillas pequeñas que indican la presencia de embriones abortados.

Ejemplo 4

Mejora de la calidad de los frutos p35S::LFY

El análisis de calidad en los frutos partenocárpicos de la plantas transgénicas que expresan el gen LFY (Tabla 1) indica un importante aumento en el contenido en sólidos solubles El análisis estadístico realizado con 4 genotipos que expresan el transgén LFY, 4 somaclones (plantas regeneradas no transgénicas) y cinco plantas del cultivar p73 (obtenidas por germinación de semillas) revela la ausencia de diferencias significativas entre las 2 poblaciones no transgénicas (3.83 y 3.63 ºBrix, respectivamente) mientras en los frutos transgénicos se observa un incremento del 60% en el contenido en sólidos solubles (la media alcanza unos 6.12 ºBrix).

Esta mejora del contenido en sólidos solubles se ve acompañada por un incremento del 60% en los ácidos valorables, ya que la media alcanza el 0.72% en los frutos procedentes de plantas que expresan el transgén LFY, mientras que en los frutos de somaclones (no transgénicos) y plantas procedentes de semillas los valores obtenidos son 0.42% y 0.49%, respectivamente.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Características de los frutos de tomate procedentes de plantas transgénicas 35S::LFY (TG), somaclones (SC = plantas regeneradas en cultivo in vitro pero no transgénicas) y plantas del cv p73 obtenidas a partir de semillas

Además, como puede verse en la Tabla 2, los frutos de las plantas transgénicas tienen un mayor contenido en azúcares, principalmente glucosa y fructosa. En los frutos de las plantas testigo los contenidos de glucosa y fructosa (mg/g de peso fresco) son 10.2 y 12.1, respectivamente, mientras que en las plantas transgénicas estos valores se duplican (21.6 y 26.8, respectivamente).

TABLA 2 Composición en azúcares (mg/g de peso fresco) en frutos de plantas testigo (cultivar p73) y frutos de plantas transgénicas p35s::LFY(9.1a, 37.2a, 42.1a, 45.3a)

Por último, conviene resaltar que los frutos de las plantas transgénicas tienen un mayor contenido de licopeno (71.3 µ/g de peso fresco) que los frutos de las plantas testigo (57.2 µ/g de peso fresco). Este aspecto resulta de gran interés porque el licopeno es una sustancia que tiene propiedades antioxidantes. (Tabla 3).

TABLA 3 Composición en licopeno, ß-caroteno y luteina (µg/g de peso fresco) en frutos de plantas testigo (cultivar p73) y frutos de plantas transgénicas p35s::LFY (9.1a, 37.2a, 42.1a, 45.3a)

Descripción de las figuras

Figura 1: Efecto de la expresión del gen LFY (histogramas más oscuros) sobre el tiempo de floración en plantas transgénicas de tomate con respecto al control o testigo -cultivar p73- (histogramas más claros). El recuento del número de fitómeros se ha realizado en plantas de 18 semanas (Los valores expresan las medias pm el error estándar de la media). Ordenadas: Número de fitómeros. Abcisas: Posición de fitómeros en la planta (hasta la primera infloración, entre 1ª, y 2ª, ...).

Figura 2: Efecto de la expresión del gen LFY (histogramas más oscuros) sobre la determinación del meristemo vegetativo del tallo principal de las plantas transgénicas de tomate frente a plantas control (histogramas más claros). (Los valores expresan las medias pm el error estándar de la media). Ordenadas: % de plantas determinadas; Abcisas: semanas de cultivo.

Figura 3: Efecto de la expresión del gen LFY (histogramas más oscuros) en relación con plantas control (histogramas más claros) sobre la altura de las plantas transgénicas de tomate cultivadas en invernadero. (Los valores expresan las medias pm el error estándar de la media). Ordenadas: altura de la planta (cm); Abcisas: semanas de cultivo.

Figura 4: Dibujo explicativo de la arquitectura de una planta de tomate cv.p73 (no transgénica) y una planta transgénica que expresa la construcción p35S::LFY.

Figura 5: Morfología y anatomía de los frutos de tomate cortados transversalmente. Fruto testigo del cultivar p73 (5a) y fruto 35S::LFY partenocárpico y apuntillado (5b).

Figura 6: fruto 35S::LFY achatado y con pocas semillas (6a) y fruto 35S::LFY achatado y partenocárpico (6b).

Figura 7: Esquema de la construcción génica pBIN19 donde se inserta el gen LFY (SEQ ID NO: 1):

•vtcortaunaOri: origen de replicación. •vtcortaunaKnR: gen de resistencia a la kanamicina. •vtcortaunaLacZ: gen reportero que codifica para la ß-galactosidasa. •vtcortaunaBamHI, SmaI, KpnI y SacI: enzimas de restricción. •vtcortaunapNOS: promotor. •vtcortaunanptII: marcador de resistencia a kanamicina.


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas de Lycopersicon, caracterizadas por poseer frutos con una composición media de sólidos solubles de 6.12 ºBrix, que comprende:

a) Insertar el gen LFY (SEQ ID NO: 1) de Arabidopsis thaliana en un vector que se introduce en un microorganismo hospedador b) Cocultivar explantes de cultivar de tomate no transgénicos con dicho microorganismo hospedador transformado c) Identificar de los transformantes primarios TG1 cuáles son plantas transgénicas diploides d) Amplificar el ADN genómico de las plantas identificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para al menos el gen LFY (SEQ ID NO: 1).

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el vector donde se inserta el gen LFY (SEQ ID NO: 1) es una construcción génica denominada pBIN19.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque dicha construcción génica incluye un promotor de control del gen LFY (SEQ ID NO: 1).

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el promotor consiste en el promotor constitutivo de p35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV).

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la construcción génica comprende también un gen marcador de selección bajo el control de un promotor específico.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 caracterizado porque el gen marcador de selección es el gen de resistencia a kanamicina (nptII) y su promotor específico es el de la nopalina sintetasa (nos).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el microorganismo hospedador es Agrobacterium tumefaciens.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la identificación de plantas transgénicas diploides de la etapa c) se realiza mediante citometría de flujo.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la amplificación del ADN genómico de las plantas transgénicas que se lleva a cabo en la etapa d) incluye también el gen marcador de selección.

10. Plantas transgénicas de tomate que expresan el gen LFY (SEQ ID NO: 1) de Arabidopsis thaliana caracterizadas por poseer frutos con una composición media de sólidos solubles de 6.12 ºBrix.

11. Plantas transgénicas según la reivindicación 10 caracterizadas porque los frutos presentan una composición media de ácidos valorables del 0.72%.

12. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 caracterizadas porque los frutos son partenocárpicos o sin semillas, en una proporción superior al 95%.

13. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 caracterizadas porque los frutos presentan un contenido medio en azúcares, particularmente glucosa y fructosa, de 21,6 y 26,8 mg/g de peso fresco respectivamente.

14. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 caracterizadas porque los frutos presentan un contenido medio de licopeno de 71,3 µg/g de peso fresco.

15. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 caracterizadas porque presentan además un porte compacto.

16. Plantas transgénicas según la reivindicación 15 caracterizadas porque presentan una altura media a las 18 semanas de crecimiento que no supera los 80 cm.


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