METODO PARA LA OBTENCION DE CULTIVARES DE TOMATE CON FRUTOS PARTENOCARPICOS (SIN SEMILLAS) Y MAYOR CALIDAD ORGANOLEPTICA.

El método se basa en la transferencia y expresión del gen LFY de Arabidopsis thaliana en plantas transgénicas de tomate. Los frutos de las plantas transgénicas con el gen LFY mantienen el mismo tamaño y peso que los del cultivar original, pero carecen de semillas, tienen más carne, menos pulpa y una forma ligeramente apuntillada. El análisis de calidad refleja un incremento del 60 % en el contenido en sólidos solubles

(la media alcanza 6,12 ºBrix) y del 60 % en ácidos valorables (la media llega al 0,72 %), lo que indica una mejora de la calidad organoléptica de los frutos en comparación con los del cultivar original no transgénico. Además, los frutos de las plantas transgénicas tienen otros atributos que indican una mayor calidad, tales como un mayor contenido en azúcares (sobre todo glucosa y fructosa) y licopeno, una sustancia que tiene propiedades antioxidantes

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200501603.

Solicitante: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACION Y TECNOLOGIA AGRARIA Y ALIMENTARIA
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC)
UNIVERSIDAD DE ALMERIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: VALENCIA.

Fecha de Solicitud: 23 de Junio de 2005.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 22 de Junio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > Plantas con flores, es decir, angiospermas > A01H5/08 (Frutos)
  • C12N15/82A4B

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > Plantas con flores, es decir, angiospermas > A01H5/08 (Frutos)
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Fragmento de la descripción:

Método para la obtención de cultivares de tomate con frutos partenocárpicos (sin semillas) y mayor calidad organoléptica.

Área de aplicación

La presente invención describe la obtención de plantas de tomate con frutos partenocárpicos (sin pepitas o semillas) mediante transferencia y expresión del gen LFY de Arabidopsis thaliana. Además de la ausencia de semillas, los frutos de estas plantas muestran un incremento de la calidad (debido a un aumento de sólidos solubles, acidez, mayor contenido en glucosa y fructosa y mayor concentración de licopeno) y mantienen el peso medio característico del cultivar original (p73) no transgénico.

Estado de la técnica

Mejora del sabor de los frutos de tomate

El sabor de los frutos del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) es un carácter complejo que guarda una relación directa con su composición química. El incremento en el contenido en sólidos solubles totales (SST) y en ácidos valorables suele estar correlacionado con el incremento de sabor (Saimbhi et al., 1995).

Gracias a la mejora tradicional, por cruzamientos entre parentales y selección de la descendencia, los cultivares modernos de tomate son híbridos adaptados a las cadenas de producción-consumo que producen frutos de buena apariencia (calibre, coloración) y larga vida post-cosecha (LSL). Sin embargo, la obtención de variedades con estas características se ha realizado sacrificando la calidad organoléptica o sensorial de los frutos (Diez & Nuez, 1995). Por ello, la recuperación de los atributos de calidad constituye hoy en día uno de los objetivos prioritarios en la mejora genética del tomate.

La mejora tradicional ha tenido un éxito muy limitado en este sentido debido a la relación negativa entre producción y contenido en sólidos solubles (Stevens 1979, 1986). La utilización de germoplasma de especies silvestres relacionadas, principalmente de Lycopersicon chmielewskii y L. cheesmanii, parece esperanzadora (Nuez, 1995). A partir de híbridos entre L. esculentum y estas especies silvestres, se han derivado líneas con un alto contenido en sólidos solubles (Risck, 1974; Hewitt & Garvey, 1987, Poysa, 1993) que se están utilizando actualmente en programas de mejora. Sin embargo, la naturaleza compleja del carácter y el ligamiento de algunos de los genes que lo controlan el contenido en SST con otros que determinan caracteres agronómicamente indeseables (eg. baja producción o reducción del calibre del fruto) dificulta notablemente su manejo en los programas de mejora (Ibarbia & Lambeth, 1969; Tanksley & Hewitt, 1988; Paterson et al., 1988; 1991; Goldman et al., 1995).

Obtención de frutos partenocárpicos

Unos de los objetivos más relevantes en la mejora del tomate es la obtención de frutos partenocárpicos, es decir frutos sin semillas. En tomate, la formación de frutos sin semillas se puede conseguir artificialmente (Bangerth & Sjuit, 1978) y suele ser una práctica habitual. Se logra mediante aplicación de auxinas como el ácido 4-clorofenoxiacético (4CPA) o el ácido 2-hidroximetil-4-clorofenoxiacético (HCPA) a los racimos florales de tomate. Sin embargo, los frutos partenocárpicos obtenidos por este método son de pobre calidad debido al escaso desarrollo de la pulpa y a una carne esponjosa insípida.

La segunda posibilidad consiste en aprovechar la partenocarpia natural debida a causas genéticas, que puede ser obligatoria o facultativa, es decir dependiente de las condiciones ambientales o de la interacción entre las condiciones ambientales y el genotipo (Ho & Hewitt, 1986). Se han descrito dos cultivares ("Severianin" y "RP75/59") como posibles fuentes de variación para aprovechar la partenocarpia facultativa (Maisonneuve, 1978). Mediante mejora tradicional se han conseguido tres cultivares partenocárpicos derivados de "Severianin": "Freda" (Costa et al., 1992), "Oregon Star" y "Oregon Pride" (Bagget et al., 1995). En estos casos, el mayor inconveniente es la dependencia que muestran estos cultivares de condiciones subóptimas para respuestas como son la formación de polen, la polinización o la fecundación, como pueden ser las temperaturas bajas (Mohamed, 1998). Factores tan variables como la duración del día, la intensidad y la calidad de la luz y las interacciones entre temperatura y luz pueden jugar un papel clave en dichas respuestas y limitar la producción de frutos sin semillas.

Para explicar la partenocarpia en "Severianin" se ha propuesto un modelo genético sencillo, según el cual el carácter estaría controlado por un simple gen, denominado pat-2 (Lin, 1982; Lin et al., 1984; Catalá y Nuez, 1990). Otros autores sugieren la intervención de un segundo gen (mp) presente en los genotipos no partenocárpicos y que podría influir en homocigosis sobre la expresión de pat-2 (Vardy et al., 1989). En el caso de la línea "RP 75/59" dos genes recesivos (distintos a pat-2 y mp) determinan la expresión de este carácter (Catalá & Nuez, 1990). La clonación y caracterización del gen pat-2 permitirían estudiar las bases moleculares del proceso de formación de un fruto partenocárpico (Fos & Nuez, 1992), pero hasta la fecha esto no ha sido factible.

Otra alternativa para inducir partenocarpia se basa en la ingeniería genética. Rotino et al., (1997) introducen en tabaco y berenjena, el gen iaaH (aislado de Pseudomonas syringae pv. savatanoi) bajo control de una secuencia reguladora específica de óvulos de Antirrhinum majus (DefH9). De esta forma se induce la síntesis de ácido indol-3-acético (AIA) durante las fases iniciales y el desarrollo del ovario, lo que conduce a la obtención de frutos partenocárpicos en estas dos especies. Sin embargo, la obtención de frutos sin semillas requiere la castración previa de las flores y, además, los autores no comentan ninguna mejora de la calidad de los frutos. En teoría, teniendo en cuenta que el efecto del transgén iaaH se basa en el mismo principio que la inducción artificial de partenocarpia, cabe pensar que, en tomate, los frutos partenocárpicos con un nivel excesivo de auxinas endógenas mostrarían una baja calidad, al igual que ocurre en el caso de los frutos sin semillas obtenidos mediante tratamiento con auxinas exógenas.

De hecho, las plantas transgénicas de tomate cv UC82 con la construcción DefH9-iaaM producen frutos malformados (Pandolfini et al, 2002). Para evitar este problema, los autores no han tenido más remedio que modular la expresión del gen introduciendo una secuencia corriente arriba que, aparentemente, limita su expresión. Con esta nueva construcción (DefH9RI-iaaM) los capullos florales de las plantas transgénicas tienen un nivel de auxina endógeno 10 veces superior al de los controles, pero 5 veces menor que el de las plantas transfolinadas con la construcción original (DefH9-iaaM). Lo interesante de este trabajo es que las plantas transgénicas de tomate con esta nueva construcción (DefH9RI-iaaM) producen frutos partenocárpicos con una morfología aparentemente normal (Pandolfini et al, 2002). A pesar de ello, con la excepción de la partenocarpia, los frutos no tienen otros atributos que indiquen una mayor calidad con respecto a los del cultivar original.

Descripción de la invención

Teniendo en cuenta la problemática anterior, en la presente invención se describe un método que permite:

•vtcortaunaLa obtención de frutos de tomate partenocárpicos (sin semillas)

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas de Lycopersicon, caracterizadas por poseer frutos con una composición media de sólidos solubles de 6.12 ºBrix, que comprende:

a) Insertar el gen LFY (SEQ ID NO: 1) de Arabidopsis thaliana en un vector que se introduce en un microorganismo hospedador b) Cocultivar explantes de cultivar de tomate no transgénicos con dicho microorganismo hospedador transformado c) Identificar de los transformantes primarios TG1 cuáles son plantas transgénicas diploides d) Amplificar el ADN genómico de las plantas identificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para al menos el gen LFY (SEQ ID NO: 1).

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el vector donde se inserta el gen LFY (SEQ ID NO: 1) es una construcción génica denominada pBIN19.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque dicha construcción génica incluye un promotor de control del gen LFY (SEQ ID NO: 1).

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el promotor consiste en el promotor constitutivo de p35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV).

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la construcción génica comprende también un gen marcador de selección bajo el control de un promotor específico.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 caracterizado porque el gen marcador de selección es el gen de resistencia a kanamicina (nptII) y su promotor específico es el de la nopalina sintetasa (nos).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el microorganismo hospedador es Agrobacterium tumefaciens.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la identificación de plantas transgénicas diploides de la etapa c) se realiza mediante citometría de flujo.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la amplificación del ADN genómico de las plantas transgénicas que se lleva a cabo en la etapa d) incluye también el gen marcador de selección.

10. Plantas transgénicas de tomate que expresan el gen LFY (SEQ ID NO: 1) de Arabidopsis thaliana caracterizadas por poseer frutos con una composición media de sólidos solubles de 6.12 ºBrix.

11. Plantas transgénicas según la reivindicación 10 caracterizadas porque los frutos presentan una composición media de ácidos valorables del 0.72%.

12. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 caracterizadas porque los frutos son partenocárpicos o sin semillas, en una proporción superior al 95%.

13. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 caracterizadas porque los frutos presentan un contenido medio en azúcares, particularmente glucosa y fructosa, de 21,6 y 26,8 mg/g de peso fresco respectivamente.

14. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 caracterizadas porque los frutos presentan un contenido medio de licopeno de 71,3 µg/g de peso fresco.

15. Plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 caracterizadas porque presentan además un porte compacto.

16. Plantas transgénicas según la reivindicación 15 caracterizadas porque presentan una altura media a las 18 semanas de crecimiento que no supera los 80 cm.