METODO NORMALIZADO Y OPTIMIZADO DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA DE TRANSCRIPTASA INVERSA CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL PARA LA DETECCION DE MRD EN LEUCEMIA.

Conjuntos de ácidos nucleicos BCR-ABL para RQ-PCR que comprenden una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº 21 y cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº 20 y SEQ ID Nº 22

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07007462.

Solicitante: UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 58, BOULEVARD CHARLES LIVON,13284 MARSEILLE CEDEX 07.

Inventor/es: GABERT,JEAN, BEILLARD,EMMANUEL, BI,WANLI, VAN DONGEN,JACQUES.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 8 de Marzo de 2004.

Fecha Concesión Europea: 14 de Octubre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68M6B

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.


Fragmento de la descripción:

Método normalizado y optimizado de reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real para la detección de MRD en leucemia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR) para la detección de enfermedad residual mínima en pacientes leucémicos a través de la amplificación de un transcrito de gen de fusión.

Antecedentes de la invención

Los protocolos de tratamiento actuales para la leucemia linfoblástica aguda (ALL), la leucemia mieloide aguda (AML) y la leucemia mieloide crónica (CML) se basan en factores de pronóstico, que contribuyen a la estratificación de la terapia.(1-3). Los factores de pronóstico clave identificados en la leucemia a lo largo de los años incluyen características antes del tratamiento tales como edad, recuento de glóbulos blancos, perfiles inmunofenotípicos, anomalías cromosómicas específicas, genes de fusión aberrantes y mutaciones, tales como alteraciones del gen FLT3 en la AML. La respuesta a la terapia inicial proporciona un marcador de pronóstico adicional bien conocido; en particular, la presencia o ausencia de blastocitos en la médula ósea tras la terapia de inducción en ALL y AML, o la respuesta citogenética en pacientes con CML.

Sin embargo, es importante hacer hincapié en que el desenlace del paciente no puede predecirse de manera fiable partiendo de la base de tales parámetros clásicos, subrayando así la posible importancia de las pruebas de enfermedad residual mínima (MRD). A lo largo de los últimos diez años, los desarrollos tecnológicos han permitido la detección de células leucémicas más allá del umbral de la citomorfología o la cariotipificación (4).

Actualmente se usan tres técnicas diferentes con una sensibilidad de al menos una célula leucémica en un fondo de 103 células normales: 1. inmunofenotipificación, 2. reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando ADN genómico para la detección de redisposiciones de clones de inmunoglobulina (Ig) y genes del receptor de células T (TCR) en ALL, y 3. transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR) para la detección de redisposiciones de genes, principalmente transcritos de FG que resultan de translocaciones cromosómicas. Aunque los dos primeros miden directamente la carga tumoral, el último método mide la expresión génica.

La información de MRD en pacientes con leucemia se ha establecido claramente como un factor de pronóstico independiente en tres situaciones patológicas: 1) ALL en la infancia, en particular tras la terapia de inducción; 2) detección de BCR-ABL en pacientes con CML tras trasplante alogénico de células madre, permitiendo la dirección de la infusiones de leucocitos del donante y 3) detección de PML-RARA en pacientes con leucemia promielocítica aguda (APL) tras la terapia de consolidación, confiriendo beneficio a la terapia preventiva en el punto de la recidiva molecular en comparación con la recidiva manifiesta. Estos datos han conducido a la introducción de la monitorización molecular en la estrategia de estratificación en algunos ensayos terapéuticos multicéntricos actuales.

Sin embargo, el impacto clínico de la detección de MRD en otros tipos de leucemias sigue teniendo que demostrarse en grandes series de pacientes.

Con el fin de abordar el problema de la falta de metodología de diagnóstico normalizada, hace ocho años laboratorios europeos realizaron un programa de colaboración a través de una acción concertada BIOMED-1.

Esta acción concertada condujo al desarrollo de ensayos de RT-PCR anidada normalizados que lograron sensibilidades de al menos 10-4 (ARN diluido en ARN) adecuadas para la detección de MRD así como para la detección diagnóstica (5).

Sin embargo, los análisis de PCR de "punto final" no permiten la cuantificación precisa de los niveles de MRD. Esta limitación se destacó por el hallazgo de bajos niveles de transcritos de AML1-ETO, CBFB-MYH111 o PML-RARA,(1) en pacientes en remisión clínica a largo plazo y por la detección de ARNm de BCR-ABL a niveles muy bajos en individuos sanos. Se ha logrado un análisis de PCR cuantitativa mediante PCR competitiva. Laboratorios expertos mostraron que esta técnica permite la predicción precisa de la recidiva, lo que sugiere que podría usarse un análisis de este tipo para adaptar el tratamiento en la CML positiva para BCR-ABL o en los pacientes con AML con transcritos de CBFB-MYH11 o AML1-ETO.

Sin embargo, esta PCR competitiva requiere mucho trabajo y lleva mucho tiempo, lo que impide tanto la normalización como el análisis multicéntrico a gran escala.

Más recientemente, se ha introducido la PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR) (6). Ha habido numerosos manuscritos de laboratorios individuales que demostraban la fiabilidad de esta tecnología y su posible valor clínico para los estudios de MRD usando transcritos de FG como dianas de PCR tales como BCR-ABL en CML, o ALL, PML-RARA, AML1-ETO y CBFB-MYH11 en AML y TEL-AML1 en pacientes con ALL.

Sin embargo, los procedimientos de RQ-PCR normalizados todavía están justificados con el fin de aplicar esta tecnología innovadora para estudios de MRD a gran escala en ensayos terapéuticos multicéntricos.

Los presentes inventores diseñaron un proyecto conjunto de protección de la salud y el consumidor de la Comisión Europea (SANCO) mediante el programa "Europe Against Cancer" (Europa contra el cáncer) (EAC) con el fin de desarrollar la normalización y el análisis de control de calidad para la RQ-PCR, basándose en la plataforma ABI 7700 (Applied Biosystems, Foster City - EE.UU.) ya que fue la primera tecnología de este tipo disponible. El objetivo principal era establecer un protocolo normalizado que permitiera la comparación de los datos de MRD con el fin de evaluar la eficacia relativa de cada estrategia terapéutica para la leucemia que lleva un marcador molecular apropiado. Se seleccionaron los transcritos de genes de fusión que se producían más frecuentemente en la leucemia, cubriendo hasta del 30 al 40% de la ALL y la AML en niños y adultos y más del 95% de los pacientes con CML.

Tal como se mencionó anteriormente en el presente documento, en comparación con la RT-PCR convencional, la RQ-PCR permite la cuantificación precisa de la expresión génica. Una característica atractiva de esta técnica es que pueden evaluarse parámetros cruciales tales como la calidad y la cantidad del ARN. Esto se lleva a cabo mediante la amplificación paralela del gen diana y uno o más genes control (CG), también denominados genes de referencia endógenos o constitutivos.

Un CG adecuado en algunas aplicaciones del análisis de RQ-PCR puede definirse como un gen con una expresión estable en todas las células nucleadas entre diferentes muestras analizadas que no resulta afectado por ningún tratamiento experimental. La amplificación alterada de los CG debe ir acompañada por una reducción correspondiente de la cantidad de transcritos del gen diana, lo que refleja variaciones en la calidad y la cantidad del ARN y en la eficacia de síntesis del ADNc. Por tanto, la cuantificación de la expresión del CG podría usarse para detectar muestras de mala calidad, basándose en valores de referencia observados en un gran número de muestras recientes. Además, la RQ-PCR permitiría evaluar una sensibilidad experimental por muestra, lo que es particularmente importante para las muestras de seguimiento negativas para la PCR.

Aunque la bibliografía sobre los ensayos de RQ-PCR está ampliándose rápidamente, hasta ahora no se ha publicado un esfuerzo concertado relacionado con la selección de CG apropiados.

La elección de un CG sigue siendo un tema crucial y todavía tiene que encontrarse un consenso. Hasta la fecha, todavía se usan numerosos CG para la detección de MRD mediante RQ-PCR: ABL, ACTB, B2M, GAPDH, PBGD, TBP y ARNr 18s. La inclusión del análisis de CG debe mejorar significativamente la fiabilidad de la detección de MRD en pacientes leucémicos.

Sin embargo, esto depende de manera crítica de la optimización y la normalización de los ensayos de CG y FG.

Sumario de la invención

Por estos motivos, los inventores de la presente solicitud se han centrado más particularmente en el diseño, la optimización y la normalización del análisis de RQ-PCR de FG con referencia especial a la selección y validación de CG adecuados para el análisis de RQ-PCR en un gran panel de muestras normales y leucémicas.

Por consiguiente, un objetivo de...

 


Reivindicaciones:

1. Conjuntos de ácidos nucleicos BCR-ABL para RQ-PCR que comprenden una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº 21 y cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº 20 y SEQ ID Nº 22.

2. Conjuntos de ácidos nucleicos BCR-ABL para RQ-PCR que comprenden una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº 21 y cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº 23 y SEQ ID Nº 22.

3. Uso de los conjuntos según la reivindicación 1 ó 2 en un método de RQ-PCR para la detección de enfermedad residual mínima en pacientes leucémicos, en el que el conjunto de la reivindicación 1 se usa para amplificar transcritos del gen de fusión BCR-ABL m-bcr y el conjunto de la reivindicación 2 se usa para amplificar transcritos del gen de fusión BCR-ABL M-bcr, y dicho método de RQ-PCR comprende:

(i) seleccionar muestras amplificables y cualificadas de pacientes para el análisis posterior; (ii)definir las condiciones óptimas para realizar la reacción de RT; (iii)definir las condiciones óptimas para el protocolo de RQ-PCR; y (iv)establecer un procedimiento normalizado para el análisis de los datos,

en el que se amplifica un transcrito de gen de control apropiado en paralelo al transcrito de gen de fusión.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que se fija un umbral común a 0,1 para estar en fase exponencial y una línea base común entre los ciclos 3 y 15.

5. Uso según la reivindicación 3 ó 4, que comprende someter muestras de ARN extraídas de las muestras que van a analizarse a una reacción de RT que comprende

quadañadir 1 µg de ARN total en 10 µl de H2O; quadincubar a 70ºC durante 10 min.; quadenfriar en hielo y añadir los siguientes reactivos hasta un volumen final de 20 µl; quadrealizar la transcriptasa inversa (o bien de MMLV o bien Superscript I o II): 100 U; quadusando: quadtampón RT (según la RTasa usada) quadDNTP: 1 Mm quadDTT: 10 Mm quadhexámeros aleatorios: 25 µM quadinhibidor de ARNasa: 20 U quadincubar posteriormente a: quadtemperatura ambiente durante 10 min.; quad42ºC durante 45 min.; y quad99ºC durante 3 min., quadcolocar la muestra a 4ºC tras la etapa de RT; y quaddiluir el ADNc final con 30 µl de H2O.

 

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