MÉTODO PARA LEER IMÁGENES, EN PARTICULAR PARA ESTUDIAR EL DESARROLLO DE UNA BIOPELÍCULA EN UN MEDIO DE CULTIVO.

Un método para leer imágenes de una base de una placa provista con al menos un pocillo (2) que contiene un medio de cultivo (1) de microorganismos caracterizado porque consiste de:

i) formar una placa opaca (5) cubriendo una superficie del medio de cultivo (1) para formar una base de lectura, y ii) obtener imágenes, en intervalos de tiempo específicos, la base del pocillo (2) usando un dispositivo óptico de obtención de imágenes

Método para leer imágenes, en particular para estudiar el desarrollo de una biopelícula en un medio de cultivo.

La invención se refiere al campo del estudio del comportamiento de cultivos de microorganismos.

La presente invención más particularmente, pero no exclusivamente, se refiere al campo del estudio del desarrollo de una biopelícula en un medio de cultivo homogéneo o no homogéneo.

La expresión “medio de cultivo” significa cualquier medio donde al menos un microorganismo es susceptible de estar presente y desarrollarse. Así, es un medio que puede ser natural o sintético. En consecuencia, el agua cae dentro de esta definición, por ejemplo. “Medio de cultivo” por lo tanto significa, de acuerdo a la invención, el microorganismo y el medio en donde puede ser encontrado, o posiblemente sólo el medio.

Las biopelículas están formadas de varias capas de bacterias o microorganismos, contenidos en una matriz sólida. Se desarrollan para formar comunidades microbianas, una de las propiedades de la cual consiste en adherirse a las superficies sumergidas, Tal adhesión es o no específica (adherencia) , o específica (adhesión propiamente) (Consterlon y otros. Bacterial Biofilms, Sciencies 1999; 284-6) :

- Adherencia o adhesión reversible: Los microorganismos existentes se acercan a las superficies por gravitación, movimientos Brownianos o quimiotactismo si tienen flagelos. Durante el primer paso de fijación que exige sólo dos fenómenos puramente físicos e interacciones fisicoquímicas débiles, los microorganismos pueden ser todavía fácilmente separados.

- Adhesión: Este paso más lento exige interacciones más fuertes así como el metabolismo microbiano y los apéndices celulares del microorganismo (flagelos, pilis, …) . La adhesión es un fenómeno activo y específico. Algunos de los primeros pioneros se van a fijar de una forma irreversible a la superficie más particularmente gracias a la síntesis de exopolisacáridos (EPS) . Este proceso es relativamente lento y depende de los factores medioambientales presentes y los microorganismos.

Tales biopelículas se pueden encontrar en todas partes en numerosos campos, en donde acarrean riesgos para la salud y pueden causar daños relativamente importantes.

En lo que respecta a la salud de los seres humanos por ejemplo, las biopelículas son responsables de infecciones que son cada vez más difíciles de contener: en el área completa nariz-oído-garganta (canal auditivo, membrana mucosa de la nariz y el seno, conjuntiva ocular…) , en los dientes (aparición de sarro, caries, …) , en los bronquios, pulmones (en pacientes que sufren de mucoviscidosis…) , al nivel del tracto urinario genital, etc. Adicionalmente, son el origen de la mayoría de las patologías nosocomiales (más de 10.000 defunciones por año) formándose al nivel de catéteres o implantes (válvulas cardiacas, caderas artificiales, catéteres urinarios…) (J.W. Costerton, P. Stewart y E.P. Greenberg, Bacterial Biofilms: “A common cause of persistent infections”. Science, volume 284, páginas 1318-1322) .

Las biopelículas también conciernen a la industria agrícola y alimenticia en cuanto a su implicación en el envenenamiento de comida (formación en la rotura de la cadena de frío, desarrollo en herramientas cortantes, herramientas abrasivas, o en las mesas de trabajo) . También están presentes en las torres de refrigeración y son responsables de infecciones por legionella.

El desarrollo y comportamiento de tales biopelículas permanece pobremente conocido sin embargo ya que su estudio es complicado, a pesar de que se han implementado muchos métodos para estudiar el desarrollo de las biopelículas.

Entre los métodos implementados para estudiar el comportamiento de tales comunidades microbianas, se conoce el descrito en la solicitud de patente internacional WO2005/090944. El método descrito en esta solicitud de patente se basa en el modelado del desarrollo de biopelículas en un medio no homogéneo, turbio y opaco correspondiente al medio de cultivo en donde los microorganismos se desarrollan para formas tales biopelículas. Dicho modelado es realizado de la medición de la viscosidad del medio de cultivo. El concepto de viscosidad sólo describe parcialmente el efecto de la biopelícula. De hecho, la biopelícula está compuesta de:

- por un lado, una cierta cantidad de exopolisacáridos (EPS) , o cualquier otra sustancia viscosa, producida por microorganismos. -por otro lado, a través de una red, un entramado de fibras y cuerpos celulares. De hecho, los microorganismos usan los apéndices celulares de los microorganismos (flagelos, pilis…) para adherirse a las superficies.

La medida más específicamente corresponde a la medida de viscosidad y a una medida de la resistencia a la tracción en los apéndices celulares. De hecho, la medición usa partículas magnetizables, magnéticas o eléctricamente cargadas (o bolas) (que pueden ser magnetizadas o cargadas eléctricamente bajo el efecto de un campo magnético, electromagnético o eléctrico) , o cubiertas con al menos una capa electromagnética o magnetizable. En el texto siguiente el término “magnético” será usado para referirse a la expresión “cargado eléctricamente” o a los términos “magnético” o “magnetizable” o a la expresión “cubierto con al menos una capa magnética o magnetizable”, indiferentemente. Tales partículas que existen en la superficie donde la biopelícula se va a desarrollar serán atrapadas por la sustancia viscosa liberada por los microorganismos y por los apéndices celulares usados por los microorganismos. Las partículas son inmovilizadas por los dos factores, en proporciones /tasas variables dependiendo de los microorganismos estudiados.

Así, el método descrito en la solicitud anteriormente mencionada consiste en:

a) sumergir al menos una partícula magnética en un medio de cultivo. El medio de cultivo está preferiblemente posicionado en uno o varios pocillos de una microplaca. b) someter el medio de cultivo a un campo magnético, eléctrico o electromagnético, de tal forma que se mueve la partícula. c) detectar el grado de libertad de movimiento de la mencionada partícula en el mencionado cultivo.

El grado de movilidad de las partículas se reduce o se anula si aumenta la viscosidad, además de la producción de EPS por el microorganismo, o si el microorganismo desarrolla apéndices celulares (flagelos, pilis…) para adherirse a una superficie, atrapando así las partículas al mismo tiempo.

Este último paso c) es realizado preferiblemente por medio de una medición óptica. Se trata de la iluminación de la base de los pocillos en la microplaca usando una fuente de luz, para iluminar la (s) partícula (s) magnética (s) , y así determinar el movimiento de la (s) partícula (s) en el medio de cultivo, comparando imágenes. Tal comparación es realizada, por un lado, antes y después del efecto de un campo magnético, eléctrico o electromagnético, y por otro lado, a intervalos de tiempo dados (un tiempo para que el microorganismo desarrolle y forme una biopelícula o no) .

Los dispositivos de detección óptica usados son dispositivos de imagen convencionales (escáner, cámara de fotos o cámara de video) . Las vistas corresponden a la base del pocillo, vistas desde abajo, por transparencia. El camino óptico convencional sucesivamente pasa a través de los siguientes elementos:

- base externa del pocillo,

- materiales que compones la base del pocillo (transparente, plástico, cristal…) ,

- base interna del pocillo,

- medio de cultivo,

- menisco del medio de cultivo,

- aire sobre el medio de cultivo.

Cualquiera que sea el sistema de obtención de imágenes, el operario del sistema afronta un problema mayor relacionado con la formación de reflexiones entre la base del pocillo y la superficie líquida del medio de cultivo por la existencia de un menisco en el medio de cultivo. La imagen obtenida por el dispositivo de detección óptica es por lo tanto particularmente compleja, o incluso algunas veces imposible de procesar.

Además de las dificultades en analizar la imagen relacionadas con el menisco formado en la superficie del medio de cultivo, el operario del experimento también tiene que afrontar un problema relacionado con el paralaje entre la imagen de los pocillos dispuestos en el centro de la microplaca, y la imagen de los pocillos dispuestos en el... [Seguir leyendo]

1. Un método para leer imágenes de una base de una placa provista con al menos un pocillo (2) que contiene un medio de cultivo (1) de microorganismos caracterizado porque consiste de:

i) formar una placa opaca (5) cubriendo una superficie del medio de cultivo (1) para formar una base de lectura, y ii) obtener imágenes, en intervalos de tiempo específicos, la base del pocillo (2) usando un dispositivo óptico de obtención de imágenes.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de obtención de imágenes comprende una primera obtención de imágenes de la base del pocillo (2) correspondiente a una imagen de referencia, después al menos una segunda obtención de imágenes tras la aplicación de un campo magnético, eléctrico o electromagnético en el medio de cultivo (1) , el medio conteniendo al menos una partícula que es magnética, magnetizable, cargada eléctricamente o cubierta con al menos una capa magnética o magnetizable.

3. El método de acuerdo a la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la capa opaca (5) está hecha por la deposición en el pocillo (2) de una composición no miscible con el medio de cultivo (1) .

4. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la capa opaca (5) está hecha por la deposición en el pocillo (2) de una composición que tiene una densidad menor que la del medio de cultivo (1) .

5. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la capa opaca (5) está hecha para formar en la superficie del medio de cultivo (1) , una capa homogénea y uniformemente distribuida.

6. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la capa opaca (5) formada es una capa opaca no reflectante.

7. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la capa opaca (5) formada es inerte.

8. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la capa opaca (5) comprende un aceite mineral translúcido que contiene un pigmento miscible.

9. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la capa opaca (5) comprende un aceite translúcido que contiene macro partículas repelentes de agua.

10. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, para analizar las imágenes desarrolladas, la base (4) del pocillo (2) está localizada de tal forma que sólo se analizan las imágenes correspondientes a la base (4) del pocillo (2) .