Método y kit para la determinación microbiológica de vitaminas en mezclas de sustancias.

Método para la determinación microbiológica cuantitativa de vitaminas,

aminoácidos individuales u otrassustancias esenciales para la vida en una mezcla de sustancias, caracterizado porque en el contenedor del cultivopara la determinación del crecimiento y metabolismo se congela inmediatamente y se seca por congelamiento unacantidad predeterminada de células vitales de un microorganismo adecuado en una solución congelante enpresencia de 200 a 500 mmol/L de trehalosa y porque las células se almacenan secas en el recipiente de cultivohasta su uso.

Método y kit para la determinación microbiológica de vitaminas en mezclas de sustancias Campo de la invención La invención se refiere a un método y a un kit para la determinación cuantitativa de sustancias importantes para la vida que se encuentran en mezclas de sustancias en general y principalmente en alimentos para animales, productos alimenticios, cosméticos, medicamentos, productos farmacéuticos, fluidos corporales, muestras médicas y otras muestras analíticas.

Antecedentes de la invención

Por vitaminas se entienden sustancias necesarias para la vida que el organismo debe ingerir mediante la alimentación. En el caso de una alimentación balanceada, la demanda diaria de vitaminas de las personas está completamente satisfecha. En caso de desnutrición o de una alimentación deficiente o de un trastorno de resorción, puede surgir una deficiencia de vitaminas y conducir a enfermedades tales como el escorbuto, beriberi, ceguera nocturna e incluso la muerte. Productos nutritivos complementarios tales como la leche de soja para los lactantes se complementan por lo tanto con vitaminas. De otra manera, los productos alimenticios también se mezclan con vitaminas. La actividad biológica de las vitaminas depende de su estructura; se indica en unidades de peso o en unidades internacionales (IE o EU) . Pero el contenido de vitaminas de una muestra se determina sólo difícilmente y con alto consumo de tiempo. Esto se aplica particularmente para las vitaminas hidrosolubles y las trazas de vitaminas B12, ácido fólico y biotina.

El contenido de vitamina en una mezcla de sustancias puede determinarse (i) mediante métodos químico-físicos, por ejemplo mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) . Estos son muy poco sensibles para trazas de vitaminas como vitamina B12, ácido fólico y biotina. (ii) con métodos inmunológicos. Estos no son suficientemente precisos para muchas determinaciones debido a efectos de matriz y tienen que adaptarse a cada matriz de la muestra. En estos surgen interferencias con otros componentes de la matriz, particularmente en el caso de nutrientes para lactantes, nutrientes para gatos suero y sangre. (iii) además, el contenido de vitaminas puede determinarse en ensayos con animales, lo cual no es relevante en la práctica, y (iv) mediante métodos microbiológicos. En este caso, se cultiva un microorganismo, para el cual la vitamina a determinarse es imprescindible, en una solución nutriente deficiente de manera específica, se mezcla con la muestra o con un estándar de vitamina y se mide su crecimiento o su metabolismo a intervalos, por ejemplo por medio de titulometría, gravimetría, turbidimetría o nefelometría. En relación con los antecedentes de la determinación microbiológica pueden mencionarse además las siguientes publicaciones: GORIN, G. et al, Appl. Microbiol., 1970, 20, 641-642; KELLEHER, BP et al., J. Clin. Pathol., 1991, 44 (7) , 592-595; BUI, M.H., J. Vitam. Nutr. Res., 1999, 69 (5) , 362-366; MOLOY, A.M. et al., Methods Enzymol., 1997, 281, 43-53; CONRAD, PB et al, Cr y obiology, 2000, 41, 17-24. En la determinación microbiológica tiene que aplicarse varias series de dilución de modo que al final del tiempo de incubación se encuentre un valor de crecimiento o metabólico en el rango de medición de las series de concentración estándar paralelas. Para cada ensayo tiene que prepararse una curva estándar válida solamente para esta mezcla. Además, por razones de seguridad y precisión, cada etapa de concentración de la serie estándar y de la serie de la muestra tiene que aplicarse al menos tres veces. El contenido de vitamina de la muestra se determine entonces por medio de comparación con los contenidos de vitamina conocidos de la serie estándar paralela. En términos generales, no son posibles datos de precisión válidos; el coeficiente de variación debe encontrarse, no obstante, en aproximadamente 10 por ciento o más bajo. La suspensión del microorganismo para la inoculación de las series estándar y de la muestra no puede almacenarse y debe cultivarse nuevamente para cada ensayo de crecimiento. Por lo tanto, existe siempre la incertidumbre de si la suspensión de inoculación fue cultivada correctamente o si el microorganismo tiene la sensibilidad y especificidad deseadas. La determinación microbiológica de las vitaminas es muy laboriosa y requiere mucho tiempo y necesita una organización del laboratorio considerable. Sólo unos pocos laboratorios en el campo de los alimentos se han especializado en este tipo de análisis. Los médicos de laboratorio han cesado de usar este método en diagnósticos humanos debido a que es muy dispendioso han que hasta hoy no se encuentran disponibles métodos equivalentes para la determinación del contenido de vitamina activo biológicamente. Tal como antes, la determinación microbiológica es sin embargo el método de referencia para todos los otros métodos.

Resumen de la invención El objetivo de la invención es proporcionar un método mejorado y un kit para la determinación microbiológica de vitaminas, aminoácidos, principalmente lisina, metionina o cistina y otras sustancias importantes para la vida tales como colina o inositol, el cual tiene la desventaja del estado de la técnica y el cual es fundamentalmente capaz de automatizarse.

Este objetivo se logra por medio de un método para la determinación microbiológica cuantitativa de vitaminas, aminoácidos individuales, o de otras sustancias necesarias para la vida, en una mezcla de sustancias, en el cual se almacena en seco en el contenedor del cultivo para la determinación microbiológica de crecimiento y metabólica un número predeterminado de células vitales de un microorganismo adecuado después de adicionar azúcares conservantes, congelar de inmediato y secar por congelamiento. Para este propósito se congelan de inmediato las células y se secan por congelamiento en una solución congelante que contiene adicionalmente 200 a 500 mmol/L de trehalosa, preferiblemente 200 a 250 mmol/L de trehalosa. La solución congelante es preferiblemente el medio de ensayo para la determinación microbiológica. En el método, las células se congelan de inmediato a una temperatura entre -10 y -100°C, preferiblemente entre - 18 y -80°C. El kit de ensayo o el equipo de prueba según la invención comprenden microorganismos preservados de esta manera en un número predeterminado en uno o varios contenedores de cultivo para los ensayos de crecimiento en las determinaciones microbiológicas. Los contenedores de cultivo son preferiblemente las cavidades de una placa de microtitulación.

El método de la invención se caracteriza porque un número exacto de células de un microorganismo adecuado se conservan de tal manera en un contenedor de prueba en la presencia de un azúcar conservante, no reductor, y de un nutriente específico para el ensayo que las células pueden almacenarse por lapsos de tiempo más largos a temperatura ambiente y que todas las células siguen creciendo homogéneamente después de la adición del líquido. El secamiento y la conservación se efectúan con modificaciones ligeras según el organismo mediante liofilización, en cuyo caso los microorganismos se congelan de inmediato a -80°C en un volumen pequeño, preferiblemente 0, 5 a 100 microlitros, particularmente preferible 1 a 10 microlitros y luego se liofilizó. El azúcar conservante no reductor es preferiblemente trehalosa. También pueden adicionarse sacarosa (sucrosa) y azúcares simples tales como dextrosa a fin de contrarrestar los daños por secamiento del microorganismo. Las concentraciones empleadas preferiblemente son 200 a 500 mmol/L de trehalosa (con o sin sacarosa) , preferiblemente 200 a 350 mmol/L de trehalosa, particularmente preferible 200 a 250 mmol/L de trehalosa. La concentración de trehalosa debe estar al menos aproximadamente en 200 mmol/L. La adición de iones divalentes tales como Ca2+ durante el secamiento mejora el inicio del crecimiento. A fin de evitar que los microorganismos durante la liofilización y el almacenamiento en seco ajusten su metabolismo a un medio deficiente, preferiblemente se congelan de inmediato y se liofilizan en el medio de ensayo de más tarde, naturalmente en ausencia de la sustancia que va a determinarse. De esta manera se evita que durante la liofilización y el almacenamiento en seco se generen microorganismos que pueden crecer sin la sustancia a determinar, la vitamina. Este tipo de microorganismos se forman regularmente de otra manera, conducen a un fondo de medición y en casos individuales a resultados erróneos.

El kit se proporciona como un producto intermedio del método de acuerdo con la invención. El kit de ensayo para la determinación microbiológica de vitaminas incluye agentes preparados tales como estándares calibrados y soluciones nutrientes... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación microbiológica cuantitativa de vitaminas, aminoácidos individuales u otras sustancias esenciales para la vida en una mezcla de sustancias, caracterizado porque en el contenedor del cultivo para la determinación del crecimiento y metabolismo se congela inmediatamente y se seca por congelamiento una cantidad predeterminada de células vitales de un microorganismo adecuado en una solución congelante en presencia de 200 a 500 mmol/L de trehalosa y porque las células se almacenan secas en el recipiente de cultivo hasta su uso.

2. Método según la reivindicación 1, en cuyo caso la solución congelante contiene 200 a 250 mmol/L de trehalosa.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en cuyo caso la solución congelante es el medio de ensayo para la determinación microbiológica.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso las células se congelan inmediatamente a una temperatura entre -10 y -100°C, preferiblemente entre -18 y -80°C y luego se secan por congelamiento.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso la sustancia que va determinarse se selecciona de vitamina B3 (niacina, ácido nicotínico, amida de ácido nicotínico) , vitamina B12 (cianocobalamina, hidroxicobalamina) , ácido fólico (ácido fólico, ácido pteroilglutámico, conjugados de ácido fólico) , biotina, ácido pantoténico (ácido pantoténico, pantenol) , vitamina B1 (tiamina, pirofosfato de tiamina) , vitamina B2 (riboflavina, fosfato de riboflavina) , vitamina B6 (piridoxina, piridoxal, piridoxamina, piridoxal-5’-fosfato) , lisina, metionina, cistina, colina, inositol.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso el microorganismo se seleccionan de

Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, Enterococcus hirae; Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus helveticus, L. veridescenc, Streptococcus faecalis.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso el contenedor del cultivo es una placa de microtitulación.

8. Kit de ensayo para la determinación microbiológica cuantitativa de vitaminas, aminoácidos individuales o de otras sustancias esenciales para la vida en una mezcla de sustancias, el cual comprende contenedores de cultivo para el desarrollo microbiológico y la determinación de metabolismo, en cuyo caso los contenedores de cultivo son los pocillos de una placa de microtitulación que contienen respectivamente una cantidad predeterminada de células vitales de un microorganismo adecuado, los cuales mediante adición de una solución congelante contienen 200 a 500 mmol/L de trehalosa y se vuelven capaces de conservarse mediante congelamiento inmediato y secamiento por congelamiento para un almacenamiento seco a temperatura ambiente.

9. Kit de ensayo según la reivindicación 8, en cuyo caso el microorganismo se selecciona de Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, Enterococcus hirae; Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus helveticus, L. veridescenc, Streptococcus faecalis.