Método y kit para la detección de secuencias de ADN específicas de Mycobacterium tuberculosis complex en muestras pulmonares.

Método y kit para la detección de secuencias de ADN específicas de Mycobacterium tuberculosis complex en muestras pulmonares.

Nuevos cebadores y al método para la detección de especies pertenecientes al Mycobacterium tuberculosis complex, y kit de detección que los comprende.

Método v kit para la detección de secuencias de ADN específicas de Mvcobacteríum tuberculosis complex en muestras pulmonares.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la medicina, 5 y se refiere a unos nuevos cebadores y al método para la detección de especies pertenecientes al Mycobacterium tuberculosis complex, así como al kit de detección que los comprende.

Estado de la técnica

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa de curso subagudo o crónico, con

altas tasas de morbilidad y mortalidad, y que continúan siendo un importante problema socio-sanitario en nuestro medio. La tuberculosis continua siendo la infección más prevalente del planeta. Se estima que 12 millones de personas están infectadas por el complejo Mycobacterium tuberculosis que incluye las especies causantes de tuberculosis en 15 humanos (M. tuberculosis, M. africanum M. canetti) y agentes causales de la tuberculosis en

animales que pueden transmitirse a humanos (M. bovis, M. microti M. caprae y M.

pinnipedii). Este enorme reservorio genera 8,7 millones de nuevos casos de tuberculosis al año y 1,4 millones de muertes directamente atribuibles a la enfermedad (WHO, 2012). En España, el número de casos declarados a la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica fue 20 de 6.746 casos para el año 2011, lo que equivale a una tasa de 14,63 casos/100.000

habitantes (RENAVE, 2012). Del total de casos, 5.043 corresponden con tuberculosis

respiratoria (10,93/100.000 habitantes) y 1.703 a tuberculosis extrapulmonar (3,69/100.000 habitantes). En cuanto a la localización anatómica de la enfermedad; 4.853 casos (72%) fueron de localización pulmonar, 121 (1,7%) fueron tuberculosis respiratoria sin especificar, 25 281 (4%) pleurales, 380 (1,4%) linfáticas, 98 (1,4%) meníngeas, 4 (0,06%) del SNC no

meníngeas, 85 (1,3%) osteoarticulares, 58 (0,95%) genitourinarias, 34 (0,9%) digestivas, 48 (0,7%) diseminadas y 784 (11,6%) clasificadas como tuberculosis extra-respiratorias sin especificar.

Tradicionalmente, el diagnostico microbiológico de la TUBERCULOSIS (TBP) se ha fundamentado en la baciloscopia, el cultivo y la identificación fenotípica. La baciloscopia o detección de bacilos ácido-alcohol resistentes proporciona una orientación diagnóstica preliminar y es el método más rápido, sencillo y económico. Sin embargo, la sensibilidad es escasa, entre el 50 y 80% de los cultivos positivos, y aunque la especificidad global es buena, esta ha disminuido en áreas con alta incidencia de aislados clínicos de micobacterias no tuberculosas (Schuger NW, 2001, Am J Resp Crit Care Med 164:2020-2024.).

Por el contrario, el cultivo continúa siendo el método de referencia debido a su especificidad y sensibilidad en muestras pulmonares, ya que permite acceder a posteriores estudios como la identificación fenotípica. El mayor inconveniente es el lento crecimiento de las micobacterias, que no permite el diagnóstico rápido, incluso con los nuevos sistemas semiautomatizados de cultivo.

El diagnóstico de la tuberculosis también puede ser indirecto mediante la demostración de granulomas caseificantes en material histológico, en el contexto de cuadro clínico compatible.

Exceptuando las tinciones en fluidos de cavidades estériles, todos los métodos convencionales de diagnóstico de la tuberculosis son lentos, oscilando entre 3 y 5 días en el caso de los métodos histológicos, a 4-6 semanas en el caso de cultivos de micobacterias (Alcaide y cois., 2005, Recomendaciones de la Sociedad de Enfermedades Infecciosas y microbiología clínica (SEIMC); Pertuiset E y cois., 1999, Medicine (Baltimore), 78: 309-20).

El diagnóstico etiológico precoz de la infección por Tuberculosis es fundamental para su adecuado tratamiento y reducción de la morbimortalidad asociada a la demora diagnóstica. Por otra parte, un diagnóstico más preciso evitaría el uso de tratamiento tuberculostático empírico, tan frecuentes en la práctica clínica y no exentos de riesgos innecesarios para los pacientes.

Para obviar en la medida de lo posible las limitaciones de los métodos diagnósticos convencionales de la tuberculosis humana, nuestro grupo ha desarrollado en los últimos

años varias técnicas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a tiempo real, aplicables al diagnóstico de la Tuberculosis humana. Tras optimizar y ensayar la técnica en diversos supuestos clínicos, se ha podido demostrar, que estas técnicas de diagnóstico molecular superan en eficacia a los métodos habituales, no solo en el diagnóstico de la 5 primoinfección, sino también en los casos de formas focales de la enfermedad (Queipo- Ortuño MI y cois., 2009, PLoS One 4(2):e4526; Colmenero JD y cois., 2012, Diagn Microbiol Infect Dis 74(1):70-2. Sanjuan-Jimenez R y cois., 2013, PLoS One 8(3):e58353; Sanjuan- Jimenez R y cois 2013, PLoS Negl Trop Dis 7(12):e2593).

Esta nueva técnica de PCR a tiempo real (RT-PCR) emplea la tecnología 10 LightCycler, que permite cuantificar la carga bacteriana y reducir el tiempo del ensayo a unos 45 min (P200801280). El proceso de la PCR a tiempo real permite una mayor automatización, lo cual redunda en una mayor simplicidad de la técnica, reducción del riesgo de contaminación y menor variabilidad Ínter e intra ensayo (Queipo-Ortuño MI, y cois., 2008, Clin Microbiol Infect., 14: 1128-34).

En los últimos años también se ha mejorado de forma notable los primitivos métodos

moleculares aplicados al diagnóstico de la tuberculosis, los cuales adolecían de una adecuada sensibilidad y presentaban problemas de especificidad. Con este objetivo se han estudiado diferentes secuencias de ADN para la identificación del complejo Mycobacteríum tuberculosis, mediante PCR convencional y PCR a tiempo real, empleando el elemento de 20 inserción IS6110, cfp32 y superóxido dismutasa, un segmento del gen hsp65, genes del ARNr 16S, región intergénica 16-23S, senX3-regX3, etc. En la mayoría de los casos, los autores aplican métodos PCR-IS6110 de diseño propio y los resultados son comparados con otras técnicas. Dichos sistemas sólo muestran buenos niveles de sensibilidad en muestras BAAR+ (Dalovisio JR y cois., 1996, Clin Infect Dis 23:1099-1106; Baba K y cois, 25 2008, Diagn Mol Pathol 17(2): 112-117) y además, los estudios comparativos indican altas

variaciones de sensibilidad y especificidad entre laboratorios (Sankar S y cois., 2011, Mol Diagn Ther 1 ;15(1 ):1-11Wallis RS y cois., 2013, Lancet Infect Dis 13(4):362-372.).

Existen numerosos estudios sobre el rendimiento de técnicas PCR para el diagnóstico de PTB, pero son limitados los trabajos que incluyen muestras de LP en la población de estudio (Shibuya et al., 2002; Moure etal., 2011; Miller etal., 2011; Tortoli et al., 2012; Tang etal., 2013).

Miller et al. (2011) comparan el rendimiento diagnóstico de Xpert MTB/RIF y una RT-PCR 5 IS6110 en 122 muestras (89 pulmonares y 23 extrapulmonares) con sospecha de TB. La

sensibilidad clínica en muestras pulmonares fue del 93% utilizando Xpert MTB/RIF y 90% con el ensayo IS6110, mientras que la especificidad fue del 97% para ambos sistemas. Ambos métodos muestran una sensibilidad del 100% en muestras BAAR+ pero disminuye hasta un 60 y 40% respectivamente en las BAAR-. Los resultados falsos negativos se correspondieron con 2 esputos 10 y 1 biopsia pleural en los casos compartidos, además de un BAL y un LP para el ensayo RT-PCR.

El estudio de Tang etal. (2013) analiza una M PCR con las dianas IS6110 e ISB9 para el diagnóstico de TB en 369 muestras clínicas, incluyendo esputo, orina, pus, BAL, JG, LCR y LP. La sensibilidad del ensayo (93,10%) fue superior a las de microscopia (69,40%) y cultivo (54,90%), mientras que la especificidad (89,60%) fue inferior a la de las técnicas convencionales (100 y 15 98,90%, respectivamente). La mayoría de falsos negativos (6%) se correspondieron con muestras

de LP con BAAR-.

La dificultad de detección en muestras pleurales ha sido descrita previamente (de Wit et al., 1992; Valdés et al., 2003; Santos et al., 2009), debido a la presencia de sustancias inhibidoras y baja carga bacteriana de las muestras.

Maurya et al. (2011) evalúan una técnica PCR-IS6110 para la detección del MTC

en 102 muestras pleurales con sospecha de TB. La sensibilidad del ensayo PCR con el método de extracción CTAB fue muy alta (95,70%), pero la especificidad diagnóstica fue muy inferior (69,10%) comparada con las técnicas de microscopia (31,90 y 96,30% respectivamente). Los autores concluyen que la PCR-IS6110 es más sensible que los 25 métodos convencionales, pero no absoluta para la identificación de todos los casos de TB pleural.

Igualmente, el estudio de Rosso et al.... [Seguir leyendo]

1.- Uso de los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para la detección y/o 5 identificación rápida y simple de especies de Mycobacterium tuberculosis complex.

2.- El uso según la reivindicación anterior, donde la detección se realiza en una muestra biológica no sérica.

3.- Un método para la detección y/o identificación de especies de Mycobacterium

tuberculosis complex que comprende:

a) extraer el ADN de una muestra biológica,

b) amplificar el ADN mediante una técnica de reacción en cadena de la polimerasa, usando los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 según se describe en cualquiera

de las reivindicaciones 1-2.

4.- El método según la reivindicación 3, donde la muestra biológica es una muestra biológica no sérica.

5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la muestra biológica es

una muestra pulmonar.

6.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde la muestra biológica se selecciona de entre: esputo, lavado bronquioalveolar, aspirado gástrico, biopsia pleural,

punciones aspirativas de aguja fina, o cualquiera de sus combinaciones.

7.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde la técnica de PCR es PCR en tiempo real (RT-PCR).

8 - Un kit que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

9.- El kit según la reivindicación anterior, que además comprende el agente intercalante 5 SYBR-Green I.

10.- El kit según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, que además comprende una muestra control.

11.- El uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 para la detección y/o

identificación de especies de Mycobacterium tuberculosis complex.