METODO Y KIT PARA LA DETECCION Y LA CUANTIFICACION DE LEGIONELLA PNEUMOPHILA.

Método y kit para la detección y la cuantificación de Legionella pneumophila.

Método para detectar y cuantificar la presencia de Legionella pneumophila en una muestra, mediante el uso de PCR a tiempo real

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800487.

Solicitante: LABAQUA, S.A.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: ALICANTE.

Inventor/es: YAÑEZ AMOROS,MARIA ADELA, CATALAN CUENCA,VICENTE.

Fecha de Solicitud: 21 de Febrero de 2008.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 12 de Enero de 2011.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12Q1/68A4

Clasificación PCT:

  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Fragmento de la descripción:

Método y kit para la detección y la cuantificación de Legionella pneumophila.

La presente invención se refiere a un método para detectar y cuantificar Legionella pneumophila en muestras clínicas y ambientales.

Antecedentes de la invención

Legionella es una bacteria Gram negativa con forma de bacilo. Es uno de los principales agentes causantes de varias pneumonías atípicas, especialmente entre personas con sistemas inmunológicos dañados. Aunque el género Legionella comprende más de 49 especies con 78 serogrupos, Legionella pneumophila es la especie patogénica más común, causante de más del 90% de los casos de legionelosis.

Legionella está presente en suelos y ambientes acuáticos naturales, en ocasiones sobrevive como parásito intracelular de amebas y ciliados. Así mismo puede encontrarse en sistemas de agua potable, torres de refrigeración y sistemas de agua residual, etc. Como consecuencia, la posible presencia de Legionella en bioaerosoles generados a partir de suelos o ambientes acuáticos posee un significativo riesgo para la salud humana.

A fin de detectar y prevenir posibles brotes de neumonía generados por la presencia de L. pneumophila algunos países regulan específicamente la vigilancia y control de L. pneumophila en agua regularmente y evalúan su presencia por cultivo sobre un medio selectivo. Sin embargo, las técnicas de control actuales consumen mucho tiempo debido a la lenta tasa de crecimiento de estas bacterias, y no resultan del todo fiables debido la incapacidad de detectar bacterias viables no cultivables, y la dificultad de aislar Legionella en muestras con altos niveles de microbiota acompañante que inhibe su crecimiento o imposibilita su aislamiento.

Para evitar estas deficiencias se utilizan técnicas de amplificación del ácido nucleico, principalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para la detección de L. pneumophila en muestras clínicas y ambientales. Existen varios métodos basados en la PCR para la detección de DNA de L. pneumophila entre los que cabe destacar:

circ Los basados en la amplificación del gen potenciador de la infectividad del macrófago (mip) (A.I. Ballard et al., "Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridization assay", J. Clin. Microbiol. 2000, vol. 38, pp. 4215-8).

circ Los basados en el gen rRNA ribosomal 16S (K. Rantakokko-Jalava et al., "Development of conventional and real-time PCR assays for detection of Legionella DNA respiratory specimens", J. Clin. Microbiol. 2001, vol. 39, pp. 2904-10; and N. Wellinghausen et al., "Detection of Legionellae in hospital water samples by quantitative real-time LightCycler PCR", Appl. Environm. Microbiol. 2001, vol. 67, pp. 3985-93).

circ Los basados el gen rRNA ribosomal 5S (EP 1.392.362 A1).

circ Los basados en el espaciador interno 23S-5S, para la detección simultánea de L. pneumophila y Legionella spp. (B.J. Herpers et al., "Real-time PCR assay targets the 23S-5S spacer for direct detection and differentiation of Legionella spp. and Legionella pneumophila", J. Clin. Microbiol. 2003, vol. 41, pp. 4815-6).

La abundante presencia de inhibidores de PCR como los ácidos húmicos y fúlvicos y los metales pesados en muestras ambientales, pueden producir resultados falsos-negativos, siendo así un importante inconveniente que superar. Han sido descritos varios métodos que permiten la obtención de DNA puro careciendo de inhibidores de PCR entre los que se incluyen la filtración rápida por gel para eliminar substancias húmicas, la filtración a través de resinas quelantes de intercambio iónico para eliminar iones de metal, la adición de polivinilpirrolidona (PVP) para eliminar polifenoles, la centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para mejorar la pureza de DNA, o la purificación de células intactas en lugar de purificación de DNA con el uso de metodologías de separación inmunomagnética (IMS).

Explicación detallada de la invención

La presente invención aporta un método alternativo para la detección y cuantificación de L. pneumophila, basado en la amplificación de un fragmento del gen dotA de L. pneumophila.

El gen dotA está implicado en la virulencia de L. pneumophila y es necesario para permitir el crecimiento de esta bacteria en macrófagos (células de L. pneumophila que poseen una mutación en dotA no pueden duplicarse porque son incapaces de penetrar en el macrófago). Su función es regular el paso de sustancias a través de la membrana, y el tráfico del fagosoma de L. pneumophila tanto durante como después de su incorporación al macrófago. Este gen, junto con el gen mip, forma parte del mecanismo que media la invasión inicial de células eucariotas y la consiguiente supervivencia y multiplicación intracelular.

El gen dotA ha sido utilizado como marcador molecular para estudiar las relaciones filogenéticas dentro del género Legionella. Sin embargo, no ha sido utilizado para detectar y cuantificar L. pneumophila en muestras ambientales y clínicas.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de Legionella pneumophila en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con una mezcla de reacción que comprende un cebador y una sonda marcada de oligonucleótidos, ambos capaces de hibridar con la secuencia polinucleotídica del gen dotA de Legionella pneumophila, la amplificación de la secuencia nucleotídica del gen dotA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la detección a tiempo real de la señal indicativa de la formación de la secuencia nucleotídica amplificada mediante la detección de la sonda marcada.

En una realización preferida de esta invención el cebador utilizado se une específicamente a una región comprendida entre la posición 450 y la posición 1950 del gen dotA de Legionella pneumophila.

En una realización aún más preferida dicho cebador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o sus secuencias complementarias.

En otra realización preferida de la invención la sonda marcada tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 3 y/o su secuencia complementaria.

En otra realización preferida de la invención la mezcla de reacción además comprende un control positivo interno. En una realización aún más preferida el control positivo interno comprende una secuencia nucleotídica no homologa a la secuencia nucleotídica del gen dotA flanqueada en ambos extremos por cebadores que hibridan con la secuencia nucleotídica del gen dotA de Legionella pneumophila, y en una realización aún más preferida la secuencia nucleotídica no homologa es la secuencia nucleotídica del gen gyrB de Aeromonas hydrophila. En una realización aún más preferida dicha secuencia nucleotídica no homologa comprende SEQ ID NO: 5 y/o su secuencia comple- mentaria.

Otra realización del método de la presente invención además comprende una sonda marcada capaz de hibridar con el control positivo interno. En una realización preferida del método de la presente invención la sonda marcada tiene una secuencia que comprende o está incluida en SEQ ID NO: 4 y/o su secuencia complementaria.

En otra realización preferida de la invención la sonda utilizada tiene una temperatura de fusión superior entre 8 a 12ºC que la temperatura de fusión de los cebadores.

En otra realización preferida, el método de la presente invención comprende la detección del marcador de la sonda degradada por la actividad exonucleasa 5'- >3' de la DNA polimerasa.

Otra realización preferida de la invención comprende además la cuantificación de la concentración de L. pneumophila en la muestra mediante la correlación de la señal detectada, con una curva estándar construida a partir de reacciones de PCR con diferentes cantidades conocidas de DNA de Legionella pneumophila.

Un segundo aspecto de la invención es el cebador que híbrida de forma específica al gen dotA de Legionella pneumophila. En una realización preferida el cebador híbrida específicamente con una región incluida dentro...

 


Reivindicaciones:

1. Método para detectar la presencia de Legionella pneumophila en una muestra, que comprende:

a) Poner en contacto dicha muestra con una mezcla de reacción que comprende

- un cebador y

- una sonda de oligonucleótidos marcada

capaces de hibridar con la secuencia polinucleotídica del gen dotA de Legionella pneumophila;

b) Amplificación de la secuencia nucleotídica del gen dotA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y

c) Detección a tiempo real de la señal indicativa de la formación de la secuencia nucleotídíca amplificada del paso b) mediante la sonda marcada del paso a).

2. Método según la reivindicación 1, donde el cebador se une específicamente a una región comprendida entre la posición 450 y la posición 1950 del gen dotA de Legionella pneumophila.

3. Método según la reivindicación 2, donde el cebador tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o sus secuencias complementarias.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la sonda marcada tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 3 y/o su secuencia complementaria.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la mezcla de reacción además comprende un control positivo interno.

6. Método según la reivindicación 5 donde el control interno positivo comprende la secuencia nucleotídica del gen gyrB de Aeromonas hydrophila flanqueada en ambos extremos por cebadores que hibridan con la secuencia nucleotídica del gen dotA de Legionella pneumophila.

7. Método según la reivindicación 6, donde la secuencia nucleotídica comprende SEQ ID NO: 5 y/o su secuencia complementaria.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 que además comprende una sonda oligonucleotídica marcada capaz de hibridar con el control positivo interno.

9. Método según la reivindicación 8, donde la sonda oligonucleotídica marcada tiene una secuencia que comprende o está incluida en SEQ ID NO: 4 y/o su secuencia complementaria.

10. Método según las reivindicaciones 8 o 9, donde la sonda tiene una temperatura de fusión de entre 8 a 12ºC superior a la temperatura de fusión de los cebadores.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende la detección del marcador de la sonda degradada por la actividad exonucleasa 5'->3' de la DNA polimerasa.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende la cuantificación de la concentración de L. pneumophila en la muestra mediante la correlación de la señal detectada en el paso c) de la reivindicación 1, con una curva estándar construida a partir de reacciones de PCR con diferentes cantidades conocidas de DNA de Legionella pneumophila.

13. Cebador que híbrida de forma específica con el gen dotA de Legionella pneumophila.

14. Cebador según la reivindicación 13, que específicamente híbrida con una región incluida entre la posición 450 y la posición 1950 del gen dotA de Legionella pneumophila.

15. Cebador según la reivindicación 14 cuya secuencia nucleotídica comprende SEQ ID NO: 1 y/o, SEQ ID NO: 2 y/o sus secuencias complementarias.

16. Sonda marcada para su uso en PCR a tiempo real, que híbrida específicamente con el gen dotA de Legionella pneumophila.

17. Sonda marcada según la reivindicación 16, que tiene una temperatura de fusión 8-12ºC, superior a la temperatura de fusión de los cebadores.

18. Sonda marcada según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17 que comprende o está incluida en SEQ ID NO: 3 y/o su secuencia complementaria.

19. Sonda marcada según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde el marcador de la sonda es detectable por la degradación de la sonda mediante actividad exonucleasa 5'->3' de la DNA polimerasa.

20. Sonda marcada según la reivindicación 19, donde el marcador es seleccionado del grupo que comprenden 6-carboxi fluoresceína (FAM), VIC, 6-carboxi-4,7,2',7'-tetracloro-fluoresceína, carboxihodamina 6G, Cy3, Cy5, Cy5.5, fluoresceína, 5'-Hexacloro fluoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxi fluoresceína (JOE), Verde Oregon 488, Verde Oregon 500, Verde Oregon 514, Rojo rodamina, Verde rodamina, rodamina, ROX, 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) o Rojo Texas.

21. Secuencia nucleotídica aislada que comprende una secuencia del gen gyrB de Aeromonas hydrophila flanqueado en ambos lados por dos secuencias del gen dotA de Legionella pneumophila, de forma que la molécula de ácido nucleico es amplificada simultáneamente con el gent dotA de Legionella pneumophila.

22. Secuencia nucleotídica aislada según la reivindicación 21, que comprende la secuencia nucleótida SEQ ID NO: 5 y/o su secuencia complementaria.

23. Sonda marcada para usar en PCR a tiempo real, que híbrida específicamente con la secuencia nucleotídica según se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22.

24. Sonda marcada según la reivindicación 23, cuya secuencia comprende o está incluida en SEQ ID NO: 4 y/o su secuencia complementaria.

25. Sonda marcada según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, donde el marcador es detectable por la degradación de la sonda mediante la actividad exonucleasa 5'->3' de la DNA polimerasa.

26. Sonda marcada según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 donde el marcador es seleccionado del grupo que comprende 6-carboxi fluoresceína (FAM), VIC, 6-carboxi-4,7,2',7'-tetracloro-fluoresceína, carboxihodamina 6G, Cy3, Cy5, Cy5.5, fluoresceína, 5'-Hexacloro fluoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxi fluoresceína (JOE), Verde Oregon 488, Verde Oregon 500, Verde Oregon 514, Rojo rodamina, Verde rodamina, rodamina, ROX, 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) y Rojo Texas.

27. Kit para llevar a cabo el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende al menos:

circ Un cebador según se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15

circ Una sonda marcada para su uso en PCR a tiempo real según se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20

circ Una secuencia nucleotídica aislada según se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22

circ Una sonda marcada para usar en PCR a tiempo real según se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26.


 

Patentes similares o relacionadas:

Biblioteca de péptidos y su uso, del 8 de Julio de 2020, de DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED: Una biblioteca de péptidos que comprende una pluralidad de péptidos diferentes en la que los péptidos comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos […]

Sistemas de conservación y procesamiento de espermatozoides, del 17 de Junio de 2020, de XY, LLC: Un procedimiento para producir una muestra de esperma de mamífero no humano adecuada para la fertilización in vitro, que incluye la etapa de: […]

Ratón nuligénico para Pint que muestra un fenotipo asociado a envejecimiento prematuro, del 10 de Junio de 2020, de REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.: Un ratón cuyo genoma comprende una inactivación de un locus del ARN no codificante largo (ARNlnc) Pint endógeno, en donde la inactivación (i) da como resultado que el […]

COMPOSICIÓN A BASE DE BIOPOLÍMEROS RECOMBINANTES Y USOS DE LA MISMA COMO BIOTINTA, del 23 de Abril de 2020, de UNIVERSIDAD DE VALLADOLID: La presente invención se refiere a composiciones que comprenden biopoiímeros recombinantes formados por combinaciones de monómeros de tipo "Recombinámeros […]

Composiciones para tratar MPSI, del 22 de Abril de 2020, de THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA: Un vector que lleva un casete de expresión que comprende un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: […]

Método para la producción de L-serina usando microorganismos modificados por ingeniería genética deficientes para las vías de degradación de la serina, del 22 de Abril de 2020, de CysBio ApS: Una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae que se ha modificado para inactivar los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.

COMPOSICIÓN A BASE DE BIOPOLÍMEROS RECOMBINANTES Y USOS DE LA MISMA COMO BIOTINTA, del 20 de Abril de 2020, de UNIVERSIDAD DE VALLADOLID: Composición a base de biopolímeros recombinantes y usos de la misma como biotinta. La presente invención se refiere a composiciones que comprenden […]

Ingeniería del genoma multiplex mediante CRISPR, del 8 de Abril de 2020, de The Regents of the University of Colorado, a body corporate: Un casete sintetizado que comprende: (i) al menos un casete de edición que comprende (a) una región homóloga a una región objetivo de […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .