Método para la identificación electroquímica de secuencias diana de nucleótidos.

Método de identificación electroquímica de secuencias diana de nucleótidos,

siendo el método del tipo según el cual:

se proporciona una muestra biológica susceptible de contener una secuencia diana de nucleótidos determinada;

se proporcionan medios de amplificación activables que comprenden nucleótidos libres, para provocar la replicación de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada y la formación de secuencias diana de nucleótidos replicadas bajo la forma de dobles cadenas de ácidos nucleicos;

se proporciona un compuesto oxido-reducible apto para reaccionar frente a dichos nucleótidos y se pone en contacto dicho compuesto oxido-reducible con dicha muestra biológica;

se activan dichos medios de amplificación activables;

se aplica un campo eléctrico a la muestra para activar dicho compuesto oxido-reducible y se mide la corriente eléctrica que atraviesa la muestra representativa de la actividad electroquímica de dicho compuesto oxido-reducible; y

se determina la presencia de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada si la corriente eléctrica disminuye;

caracterizado porque se proporciona un compuesto oxido-reducible que se intercala durante la replicación entre los nucleótidos que forman dichas secuencias diana replicadas, provocando dichas secuencias diana replicadas la inhibición de la actividad electroquímica de dicho compuesto oxido-reducible intercalado debido a lo cual la corriente eléctrica disminuye.

Método para la identificación electroquímica de secuencias diana de nucleótidos

La presente invención se refiere a un método y a un sistema de identificación electroquímica de secuencias diana de nucleótidos.

Un campo de aplicación a considerares principalmente el análisis rápido de muestras biológicas susceptibles de contener bacterias o virus, y más generalmente cualquier ácido nucleico.

Los métodos de detección electroquímica ya conocidos permiten poner en evidencia secuencias diana de ácidos nucleicos. Algunos de ellos utilizan a la vez procesos de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo tipo PCR (Polymerase Chain Reaction en inglés), y procesos de voltamperometría cíclica. Según uno de dichos métodos, se proporciona una muestra biológica que contiene un ácido nucleico que incluye una secuencia diana de nucleotídicos determinada y se le añade a la muestra biológica un agente oxidante apto para oxidar al menos una de las bases nucleotídicas de la secuencia diana. Los medios de amplificación comprenden nucleótidos de un tipo que incluye la base nucleotídica oxidable y los nucleótidos están destinados, evidentemente, a ser consumidos durante la realización del proceso de amplificación con el fin de producir secuencias de ácidos nucleicos replicados. Simultáneamente, o después de cada etapa de amplificación, se aplica un campo eléctrico a la muestra para provocar la reacción del agente oxidante con la base nucleotídica oxidable y se mide la corriente eléctrica que atraviesa así la muestra. Según este método, descrito más particularmente en el documento PCT/FR27/373, se determina la presencia de la secuencia dianarelevante así como su cantidad inicial cuando la corriente eléctrica disminuye durante las amplificaciones. En efecto, durante el proceso de amplificación, la cantidad de nucleótidos libres de los medios de amplificación disminuye, ya que se incorporan a los ácidos nucleicos sintetizados. Entonces, el agente oxidante sólo puede reaccionar con una cantidad cada vez más limitada de nucleótidos libres. Por tanto, se producen cada vez menos transferencias electrónicas debidas a la reacción de oxidación, lo que disminuye la corriente eléctrica.

Así, este método permite detectar y cuantificar rápidamente la presencia de un ácido nucleico dado en una muestra

biológica cualquiera.

Un problema que se presenta y que pretende resolver la presente invención es no sólo proporcionar otro método de detección electroquímico que permita detectar la presencia de una secuencia diana de nucleótidos en una muestra biológica, sino también poder identificar su naturaleza y cualificarla.

Con el objetivo de resolver dicho problema, según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de Identificación electroquímico de secuencias diana de nucleótidos. Dicho método, del tipo donde se proporciona una muestra biológica susceptible de contener una secuencia diana de nucleótidos determinada y medios de amplificación actlvables que comprenden nucleótidos libres, puede provocar la replicación de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada y la formación de secuencias diana de nucleótidos replicadas. Según el método, se proporciona también un compuesto oxldo-reduclble apto para reaccionar con dichos nucleótidos, poniéndose en contacto dicho compuesto óxldo-reduclble con dicha muestra biológica. Se activan entonces los medios de amplificación activables y se aplica un campo eléctrico a la muestra para activar el compuesto oxido-reducible, midiéndose la corriente eléctrica que atraviesa dicha muestra, que representa la actividad electroquímica del compuesto. De este modo se determina la presencia de la secuencia diana de nucleótidos determinada cuando disminuye la corriente eléctrica. Según la invención, se proporciona un compuesto oxido-reducible apto para intercalarse durante la replicación entre los nucleótidos que forman dichas secuencias diana replicadas, donde dichas secuencias diana replicadas provocan la inhibición de la actividad electroquímica de dicho compuesto oxido-reducible intercalado, disminuyendo con ello la corriente eléctrica.

Además de los nucleótidos libres, los medios de amplificación activables comprenden iniciadores que son ácidos oligonucleotídlcos específicos y complementarios de la secuencia diana de nucleótidos a detectar y una polimerasa.Por otra parte, tal como se explicará a continuación detalladamente, se aplica el campo eléctrico a dicha muestra poniendo en contacto ésta con electrodos y aplicando una diferencia de potencial entre los electrodos.

Así, una característica de la invención es que proporciona un compuesto oxido-reducible que no va oxidar las bases nucleotídicas de los nucleótidos libres en la muestra, tal como es el caso en el documento delatécnica antes citado, sino que va a Intercalarse entre los nucleótidos que forman las secuencias diana replicadas.

Preferentemente, se activan dichos medios de amplificación activables según ciclos de amplificación sucesivos y en cada ciclo de amplificación se duplica dicha secuencia diana replicada. El compuesto oxido-reducible se intercala entonces entre los nucleótidos que forman dichas secuencias diana replicadas y pierde su actividad óxido-reductible debido al campo eléctrico aplicado. Por tanto, durante los ciclos de amplificación, la señal eléctrica medida disminuye.

Ventajosamente, se registra entonces el número de ciclos de amplificación correspondiente a la disminución de la corriente eléctrica para determinar la concentración de dicha secuencia diana de nucleótidos en la muestra. En efecto, la disminución de la señal medida es proporcional a la cantidad de secuencias diana de nucleótidos replicada. Gracias a esta proporcionalidad, es posible deducir la cantidad de secuencia diana de nucleótidos presente inicialmente en la

muestra. De este modo, se repite la activación de dichos medios de amplificación activables siguiendo cierto número de ciclos de amplificación, registrándose el número de ciclos de dichos medios de amplificación cuando la corriente eléctrica disminuye con el fin de determinar la concentración de la secuencia diana de nucleótidos en la muestra. En efecto, cuanto más secuencias diana de nucleótidos contiene la muestra biológica, menor será el número de ciclos de amplificación necesarios para que disminuya la intensidad de corriente eléctrica. Y a la inversa, cuanto menos secuencias diana contiene la muestra, mayor será el número de ciclos de amplificación. Así, como se explicará detalladamente a continuación, dicho método permite igualmente cuantificar la concentración de una secuencia diana determinada en el interior de la muestra biológica.

Se señala que compuesto oxldo-reducible se refiere no solamente a los compuestos red-ox, sino también a compuestos aptos para oxidarse en ciertas condiciones y en otras aptos para reducirse.

Según una forma de realización de la invención particularmente ventajosa, una vez que la secuencia diana de nucleótidos ha sido amplificada, se provee además de energía térmica a la muestra para provocar la liberación de dicho compuesto oxldo-reducible Intercalado, aplicándose un campo eléctrico a la muestra para registrar simultáneamente las variaciones de la corriente eléctrica que la atraviesa. Se determina entonces la energía térmica Q correspondiente a las variaciones máximas de la corriente eléctrica registradas para identificar la naturaleza de la secuencia diana de nucleótidos. Ventajosamente, se provee energía térmica a dicha muestra de modo que se provoca un aumento progresivo de su temperatura. Así, se registran las variaciones de corriente eléctrica en función de la energía térmica cedida, o más concretamente de la temperatura en un intervalo dado. A partir de la variación máxima de la corriente eléctrica a una temperatura dada, se identifica la naturaleza de la secuencia diana de nucleótidos. En efecto, según la naturaleza de la secuencia diana amplificada, la variación máxima de la corriente eléctrica a una temperatura dada es característica de dicha secuencia diana de nucleótidos replicada.

De este modo, cuando se proporciona suficiente energía térmica a la muestra y por tanto a las secuencias diana de nucleótidos replicadas, las dobles cadenas de las secuencias diana replicadas tienden a separarse en dos monocadenas y a liberar así el compuesto oxido-reducible intercalado, que recupera entonces su actividad electroquímica. Las dobles cadenas de las secuencias diana de nucleótidos replicadas se separan unas de otras para una agitación térmica dada, es decir a una temperatura dada, de modo que la liberación del compuesto oxido-reducible, que... [Seguir leyendo]

Método de identificación electroquímica de secuencias diana de nucleótidos, siendo el método del tipo según el cual:

se proporciona una muestra biológica susceptible de contener una secuencia diana de nucleótidos determinada;

se proporcionan medios de amplificación activables que comprenden nucleótidos libres, para provocar la replicación de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada y la formación de secuencias diana de nucleótidos replicadas bajo la forma de dobles cadenas de ácidos nucleicos;

se proporciona un compuesto oxido-reducible apto para reaccionar frente a dichos nucleótidos y se pone en contacto dicho compuesto oxido-reducible con dicha muestra biológica; se activan dichos medios de amplificación activables;

se aplica un campo eléctrico a la muestra para activar dicho compuesto oxido-reducible y se mide la corriente eléctrica que atraviesa la muestra representativa de la actividad electroquímica de dicho compuesto oxido-reducible; y

se determina la presencia de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada si la corriente eléctrica disminuye;

caracterizado porque se proporciona un compuesto oxido-reducible que se intercala durante la replicación entre los nucleótidos que forman dichas secuencias diana replicadas, provocando dichas secuencias diana replicadas la inhibición de la actividad electroquímica de dicho compuesto oxido-reducible intercalado debido a lo cual la corriente eléctrica disminuye.

Método de identificación según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios de amplificación activables se activan según ciclos de amplificación sucesivos y porque en cada ciclo de amplificación se duplica dicha secuencia diana replicada.

Método de identificación según la reivindicación 2, caracterizado porque se registra el número de ciclos de amplificación correspondiente a la disminución de la corriente eléctrica para determinar la concentración de dicha secuencia diana de nucleótidos en la citada muestra.

Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende además las etapas siguientes:

proporcionar energía térmica a dicha muestra para provocar la liberación del compuesto oxido- reducible intercalado, y aplicar un campo eléctrico a la muestra para registrar simultáneamente las variaciones de corriente eléctrica que la atraviesan y,

determinar la cantidad de energía térmica Q correspondiente a las variaciones máximas de la corriente eléctrica registradas para identificar la naturaleza de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada.

Método de identificación según la reivindicación 4, caracterizado porque se proporciona energía térmica a la muestra de modo que se provoca un aumento progresivo de la temperatura de la muestra.

Método de identificación según la reivindicación 5, caracterizado porque se provoca un incremento progresivo de la temperatura entre 4°C y 98°C.

Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se mide la corriente eléctrica representativa de la actividad electroquímica del compuesto oxido-reducible a una temperatura predeterminada de dicha muestra.

Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 y 7, caracterizado porque dicha temperatura predeterminada es ligeramente inferior a la temperatura de la muestra correspondiente a la cantidad de energía térmica Q determinada.

Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se utiliza una voltamperometría para medir dicha corriente eléctrica.

Método de identificación según la reivindicación 9, caracterizado porque se utiliza una voltamperometría de onda cuadrada.

Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado porque dicho compuesto oxido-reducibles provisto es un compuesto orgánico que intercala ADN.

12. Método de identificación según las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado porque dicho compuesto oxido- reducible provisto es un complejo de un metal de transición.

13. Método de identificación según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho compuesto oxido-reducible presenta al menos un ligando intercalado de secuencia de ácido nucleico.

14. Método de identificación según la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque dicho compuesto oxido-

reducible incluye el ligando dipiridofenazina.

15. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque dicho compuesto oxido-reducible incluye al menos un ligando bipiridina.

16. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque dicho

compuesto oxido-reducible no oxida las bases nucleotídicas de los nucleótidos libres.

17. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dichos medios de amplificación activables son de tipo PCR.

18. Sistema de identificación electroquímica de secuencias diana de nucleóticos, comprendiendo dicho sistema:

medios (12, 14) para recibir una muestra biológica susceptible de contener una secuencia diana de 15 nucleótidos determinada;

medios de amplificación activables que comprenden nucleótidos libres, para provocar la replicación de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada y la formación de secuencias diana de nucleótidos replicadas;

un compuesto oxido-reducible apto para reaccionar frente a dichos nucleótidos, estando en contacto 2 dicho compuesto oxido-reducible con la muestra biológica;

medios de activación (32, 34, 36) para activar dichos medios de amplificación activables;

medios (2, 22, 24, 26, 28, 36) para aplicar un campo eléctrico a dicha muestra para activar dicho compuesto oxido-reducible y medios de medida de la corriente eléctrica que atraviesa dicha muestra representativa de la actividad electroquímica de dicho compuesto oxido-reducible; y 25 medios (24, 36) para determinar la presencia de dicha secuencia diana de nucleótidos determinada si

la corriente eléctrica disminuye;

caracterizado porque el compuesto oxido-reducible se selecciona entre compuestos aptos para intercalarse durante la replicación entre los nucleótidos que forman dichas secuencias replicadas, provocando dichas secuencias diana replicadas la inhibición de la actividad electroquímica del compuesto oxido-reducible 3 intercalado, disminuyendo por tanto la corriente eléctrica.

19. Sistema de identificación según la reivindicación 18, caracterizado porque dichos medios de activación (32, 34, 36) están adaptados para activar los citados medios de amplificación activables según ciclos de amplificación sucesivos para duplicar la secuencia diana replicada en cada ciclo de amplificación.

2. Sistema de identificación según la reivindicación 19, caracterizado porque comprende además medios de

registro (36) para registrar el número de ciclos de amplificación correspondiente a la disminución de la

corriente eléctrica con el fin de determinar la concentración de dicha secuencia diana de nucleótidos en la muestra.

21. Sistema de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 2, caracterizado porque comprende además:

medios para proporcionar energía térmica (32) a dicha muestra para provocar la liberación del

compuesto oxido-reducible intercalado, y medios (2, 22, 24, 26, 28, 36) para aplicar un campo eléctrico a dicha muestra para registrar simultáneamente las variaciones de corriente eléctrica que la atraviesan y,

medios para determinar la cantidad de energía térmica correspondiente a las variaciones máximas de corriente eléctrica registradas para identificar la naturaleza de dicha secuencia diana de nucleótidos 45 determinada.