Un método in vitro de identificación de un compuesto para modular la cascada de señales Wnt que está basado en la identificación de una pareja de fijación a un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 que comprende:

(a) poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto a cribar; y

(b) determinar si el compuesto afecta a una actividad de dicho polipéptido o si se ha producido fijación del compuesto a dicho polipéptido

Método para identificación de un compuesto para modulación de la cascada de señales Wnt.

La presente invención se refiere a un método para identificación de un compuesto para modulación de la cascada de señales Wnt que está basado en la identificación de una pareja de fijación, activador/agonista o inhibidor/antagonista de Kremen 1 y/o Kremen 2.

La tumorigénesis representa un proceso complejo multietápico en el cual se cree que cambios genéticos y factores ambientales desregulan los procesos celulares que controlan la proliferación y diferenciación celular. Entre otras, la cascada de señales Wnt juega un papel crucial en lo que respecta a la regulación de la proliferación y diferenciación de las células durante la embriogénesis, como se muestra, v.g., en Drosophila, Xenopus y ratones (Nusse y Varmus, Cell 69 (1992), 1073-1087). Los genes Wnt codifican glicoproteínas secretoras que activan una cascada de señales bien caracterizada por la vía de un receptor Wnt denominado "frizzled (rizado)". Ejemplos más notables de efectores de esta cascada de señales son beta-catenina y el gen supresor de tumores APC (Miller y Moon, Genes Dev. 10 (1996), 2527-2539). Varios estudios indican que una cascada de señales Wnt aberrante podría estar implicada en el desarrollo del cáncer de colon, el cáncer de mama y el melanoma (Pfeifer, Science, 275 (1997), 1752-1753; Polakis, Genes Dev. 14 (2000), 1837-1851). El primer gen codificante de una proteína de la cascada de señales Wnt, int-1, se aisló a partir del virus del tumor mamario del ratón (MMTV) y pudo demostrarse que se trata de un oncogén. Se supone que una regulación aberrante de la actividad de Wnt y/o componentes de la cascada de señales Wnt aguas abajo de la señal Wnt, v.g., beta-catenina y APC, están implicados en la tumorigénesis. En estudios recientes, pudo identificarse una nueva familia de genes, Dkk ("Dickkopf"), que actúan como inhibidores de Wnt.

DKK1 fija e inhibe el correceptor de Wnt LRP 5/6 (Zorn, Curr. Biol. 11 (2001), R592-595) pero por lo demás, se conoce acerca del mecanismo de modulación de la cascada de señales Wnt por Dkk.

WO 00/77239A describe una proteína (TANGO 202) que comprende 475 aminoácidos, siendo los primeros 473 aminoácidos idénticos a Kremen 1 sin describir función biológica alguna de esta proteína. WO 02/02603A describe una proteína (PMMM-6) que presenta cierta identidad con Kremen 2. Sin embargo, sin embargo, su función biológica no se describe.

De acuerdo con ello, medios para la terapia o diagnosis de enfermedades asociadas con una cascada de señales Wnt dis-regulada no estaban disponibles. Así, el uso de marcadores moleculares fiables de diagnóstico podrían ser útiles para una comprensión de la base molecular de enfermedades asociadas con una cascada de señales Wnt aberrante, v.g. tumores, v.g., para distinguir tejido benigno de tejido maligno. Adicionalmente, la señalización de Wnt está implicada en la fibrosis renal (Surendran, Am. J. Physiol Renal Physiol 282 (2002) 431-441), la enfermedad de riñón poliquístico (Saadi-Kheddouci, Oncogene 20 (2001) 5972-5981) y el receptor de Dkk LRP5 está implicado en el síndrome del trastorno autosómico recesivo osteoporosis-pseudoglioma (que afecta a los huesos y los ojos (OPPG; Gong, Cell (2001) 107, 513-523). Puede esperarse que tales marcadores sean útiles también para terapia y para el desarrollo de nuevas vías terapéuticas para el tratamiento de enfermedades dependientes de la cascada de señales Wnt, v.g. tumores o enfermedades de los riñones, huesos y ojos.

Así, el problema técnico que subyace en la presente invención es proporcionar un ensayo para identificar un compuesto útil para la terapia de enfermedades asociadas con una cascada aberrante.

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Durante los experimentos que han conducido a la presente invención, pudieron identificarse dos genes, Kremen 1 y 2, cuyos productos se fijan con afinidad alta a los polipéptidos Dkk1 y Dkk2. Pudo demostrarse que esta fijación tiene importancia fisiológica dado que la cotransfección de células con dkk1 así como Kremen 1 y 2 da como resultado una inhibición sinérgica de la activación de la cascada de señales Wnt. Estos datos demuestran que Kremen (1 y 2) puede considerarse como un receptor para los polipéptidos Dkk y que la función biológica de Kremen es la mediación de la inhibición de la cascada de señales Wnt por polipéptidos Dkk. Los datos obtenidos proporcionan evidencia de que la expresión de Kremen es muy compleja y que los genes que codifican kremen están implicados en una diversidad de funciones biológicas y podrían tener actividad supresora de tumores. Así pues, Kremen es útil para la diagnosis y el desarrollo de terapias para enfermedades mediadas por Wnt. Puede esperarse que, v.g., la inhibición de la cascada de señales Wnt por aumento de la expresión de kremen y/o por estimulación de la actividad del polipéptido propiamente dicho podría tener efecto terapéutico. Por otra parte, el receptor Kremen (o el gen que codifica el mismo) puede considerarse como un fármaco diana que permite la identificación de compuestos útiles para terapia.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Alineación multisecuencia de ácido nucleico de cDNAs que codifican Kremen 1 (kremen1) y 2 (kremen2) de ratón y humanos

hkremen1 y 2 se deducen de la secuencia del genoma humano en bases de datos públicas. Los nucleótidos idénticos se hacen resaltar en negro.

Figura 2: Alineación multisecuencia de aminoácidos de proteínas Kremen 1 y 2 deducidas de cDNAs de ratón y humanos (véase Figura 1)

Los aminoácidos idénticos se hacen resaltar en negro, y los aminoácidos similares se representan en gris.

Figura 3: Kremen es un receptor de afinidad alta para Dkk1 y Dkk2

Se transfectaron células 293T con plásmidos de expresión dirigidos por el promotor del citomegalovirus (CMV) que codificaban mkrm1 (superior) o mkrm2 (inferior) como se indica, se incubaron con Dkk1-AP, Dkk2-AP o Dkk3-AP recombinantes, y se tiñeron respecto a actividad fijada de AP. ARRIBA: Curvas de fijación y análisis Scatchard de la fijación de proteínas de fusión DKK-AP a células mkrm2 transfectadas. ABAJO: Curvas de fijación para la fijación de Dkk-APs a células mkrm1 transfectadas. Se indican las constantes de disociación (K_d); a, c: Curvas de fijación; b, d, e: Análisis Scatchard.

Figura 4: Kremen y Dkk1 inhiben sinérgicamente la cascada de señales Wnt

Se transfectaron células de riñón 293 con el informador Wnt (TOP-FLASH) con o sin los genes indicados. Dos días después de la transfección, se determinó la actividad de luciferasa expresada. RLU: unidades relativas de luz (normalizadas contra luciferasa cotransfectada de Renilla). Xdkk1 = dkk1 de Xenopus; mkrm1,2 = Kremen 1,2 de ratón; wnt = Wnt1 de ratón, fz = frizzled8 de ratón; Irp6 = Irp6 humano.

Figura 5: Expresión de kremen en los ratones

La expresión de kremen 1 y kremen 2 se analizó por RT-PCR, en diversos tejidos de ratones adultos. Los resultados se normalizaron utilizando expresión constitutiva de la histona H4. Abreviaturas: -RT = muestra de control en la cual se omitió la transcriptasa inversa; sk muscle = músculo esquelético; mam. gland = glándula mamaria; H4 = Histona 4 como control de carga; mkrm1,2 = kremen 1,2 de ratón.

La presente invención se refiere a un método in vitro de identificación de un compuesto para modular la cascada de señales Wnt que está basado en la identificación de una pareja de fijación a un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 que comprende:

Como se utiliza en esta memoria, el término "polipéptido Kremen 1" y "polipéptido Kremen 2" se refiere no sólo a polipéptidos codificados por la secuencia de nucleótidos que se representa en Figura 1 y/o 2 sino también a polipéptidos que difieren en secuencia de amino-ácidos debido a inserción, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos y que muestran...

1. Un método in vitro de identificación de un compuesto para modular la cascada de señales Wnt que está basado en la identificación de una pareja de fijación a un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 que comprende:

2. Un método in vitro para identificar un compuesto para modular la cascada de señales Wnt como un activador/agonista o inhibidor/antagonista de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2, que comprende los pasos de:

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el compuesto candidato o el compuesto a cribar es un anticuerpo que reconoce Kremen 1 y/o Kremen 2.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el compuesto candidato o compuesto a cribar es una molécula pequeña.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el compuesto candidato o compuesto a cribar es un ácido nucleico.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el cribado implica células que expresan Kremen 1 y/o Kremen 2.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el ensayo se lleva a cabo utilizando preparaciones exentas de células.