Método de identificación de células con nanopartículas de oro por reducción de iones hidrógeno El método de identificación de células comprende la unión de proteínas específicas de superficie de las células inmovilizadas en la superficie del transductor electroquímico con anticuerpos específicos conjugados con nanopartículas de oro,

y la posterior detección y cuantificación de la nanopartícula mediante la generación de hidrógeno catalizada por dicha nanopartícula a un potencial apropiado. También comprende su aplicación en un método de diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad que implique la expresión de proteínas de superficie de las células y los kits correspondientes

Método de identificación de células con nanopartículas de oro por reducción de iones hidrógeno.

La presente invención se refiere a un método de identificación de células, basado en el uso de nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células y en la utilización de un método electrocatalítico para la detección de estas nanopartículas, así como su aplicación en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad.

Estado de la técnica

La detección de células, en particular células tumorales, ha sido un campo de gran interés en los últimos años. Este interés es debido al hecho de que la presencia de estas células en sangre periférica es indicativa de una enfermedad, así como de una baja efectividad en tratamientos terapéuticos.

Los métodos actuales utilizados para el diagnóstico, como por ejemplo citometría de flujo e histoquímica son poco precisos, caros, con tiempos de análisis largos y requieren de instrumentación muy avanzada. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos basados en la detección de células utilizando anticuerpos específicos.

Por otro lado, el uso de biosensores para la identificación de células se ha desarrollado para el seguimiento de los cambios morfológicos y fotoquímicos de células adheridas a estos sensores, usando un sistema de detección de impedancia eléctrica y el estudio de la respuesta celular a sustancias químicas, como por ejemplo la monitorización de la acidificación del medio en cultivos de células vivas.

En alguno de los métodos mencionados anteriormente, se requiere la inmovilización de las células en una superficie, como la superficie de un transductor electroquímico. Esta inmovilización se realiza mediante técnicas de adsorción, sándwich, de atrapado o uniones covalentes entre otras. Estas técnicas presentan el inconveniente que dificultan la fijación de las células en la superficie del transductor y su posterior análisis. Asimismo, la limitación básica de las técnicas de adsorción y atrapado pasivo es la inestabilidad de las células durante el uso continuado de éstas.

Se ha demostrado que un aumento en la porosidad de la superficie favorece esta inmovilización celular. Las nanopartículas pueden utilizarse para inducir este aumento de la porosidad, formando interfases o matrices biomiméticas no tóxicas entre la célula y la superficie del transductor electroquímico. La débil interacción entre las nanopartículas y la superficie de las células aporta un ambiente similar a un sistema nativo y permite una mayor libertad de orientación de las biomoléculas. Estas matrices poliméricas están formadas por las nanopartículas y productos con una buena biocompatibilidad y alta capacidad gelificante como puede ser el chitosan. En estos casos concretos que existe un recubrimiento de la superficie del transductor, la detección de la presencia de las células se realiza mediante la correlación mostrada entre el incremento de la resistencia de transferencia de electrones y la concentración de las células en la superficie del transductor.

En el caso de las nanopartículas de oro (AuNPs), éstas presentan propiedades electroactivas que hacen que la detección electroquímica esté especialmente indicada, aprovechando así las ventajas intrínsecas de las técnicas electroquímicas (tales como polarografía Diferencial de Pulso, voltamperometría de pulso diferencial, voltamperometría de onda cuadrada y potenciometría) como son su rapidez, sencillez y bajo coste. Habitualmente, esta detección se lleva a cabo indirectamente, disolviéndolas en una mezcla de ácido bromhídrico/bromo y detectando posteriormente la solución de Au³⁺ resultante. Últimamente se han desarrollado métodos de detección directa, basados en una oxidación electroquímica de las AuNPs a Au³⁺ (cf. Pumera et al., "Direct voltammetric determination of gold nanoparticles using graphite-epoxy composite electrode", Electrochimica Acta 2005, vol. 50, pp 3702-3707) sobre la superficie del transductor electroquímico y posterior detección in-situ. Asimismo, existen otros métodos indirectos basados en el efecto catalítico que ejercen las AuNPs sobre la reducción de ciertos iones. En la mayoría de estos casos, la sensibilidad de la detección se aumenta por deposición química o electroquímica de plata en la superficie de la nanopartícula.

Aunque estos métodos catalíticos presentan una mayor sensibilidad que los métodos directos, todavía existen ciertos inconvenientes, como por ejemplo, tiempos de análisis prolongados debido a la complejidad de los procesos implicados en la detección, o el estricto control de las condiciones de reacción, como es el caso de las condiciones de deposición de la plata sobre la superficie de la AuNPs.

Así, de lo que se conoce en el estado de la técnica se desprende que todavía existe la necesidad de proporcionar métodos que aporten una mayor sensibilidad, exactitud y rapidez, y que al mismo tiempo, requieran instrumentación más sencilla y manejable, para mejorar la identificación de células y establecer más rápidamente el diagnóstico y/o el pronóstico de una enfermedad.

Explicación de la invención

Los investigadores han encontrado un método de identificación de células, basado en el uso de nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células a identificar y en la utilización de un método electrocatalítico que mide la corriente catódica generada en la evolución de hidrógeno por reducción de los iones de hidrógeno del medio, siendo la reducción catalizada por las nanopartículas de oro.

Este método es ventajoso porque permite la identificación de células mediante un método rápido y sensible, así como llevar a cabo el diagnóstico y/o de pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente susceptible de presentar la enfermedad y sus correspondientes kits de identificación, de diagnóstico y/o de pronóstico de manera rápida y precisa.

Así, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método de identificación de células que comprende: (a) Poner en contacto un transductor electroquímico y las células a identificar en un medio de cultivo apropiado a una temperatura determinada y durante el tiempo necesario, para inmovilizar y hacer crecer las células en la superficie del transductor electroquímico; (b) Poner en contacto una suspensión de nanopartículas de oro con un anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células a identificar; (c) Poner en contacto las células inmovilizadas en la superficie del transductor electroquímico con las nanopartículas de oro (8) resultantes de la etapa (b), a una temperatura apropiada; (d) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado en un medio ácido, con lo cual se produce la reducción catalizada por las nanopartículas de oro (8), de los iones hidrógeno del medio a hidrógeno; (e) Medir la corriente catódica generada en la reducción de los iones hidrógeno; (f) Restar el valor neto de la corriente generada por el transductor electroquímico sin células inmovilizadas, del valor obtenido en el apartado (e) y correlacionar la diferencia de intensidad de corriente observada con la presencia o ausencia de nanopartículas de oro (8) unidas a las proteínas de superficie de las células a identificar.

Este método de identificación de células está basado en las propiedades catalíticas de las nanopartículas de oro para la generación de hidrógeno a partir de los iones hidrógeno. Las nanopartículas de oro en un medio ácido a un potencial adecuado, reducen catalíticamente los iones hidrógeno, generando hidrógeno y una corriente catalítica asociada. Esta corriente se mide cronoamperométricamente. La cronoamperometría consiste en someter a un potencial fijo al electrodo de trabajo y registrar la corriente generada a lo largo del tiempo. Para ello, se puede utilizar cualquier potenciostato-galvanostato que integre un sistema de medida y registro de corrientes. Posteriormente se correlaciona la diferencia de intensidad de corriente generada con la presencia o ausencia de las células de interés.

Un sistema potenciostato-galvanostato permite realizar pruebas electroquímicas, suministrando una diferencia de potencial controlada y registrando la corriente que circula a través de una celda electroquímica (modo Potenciostato) o suministrando una corriente controlada...

1. Método de identificación de células que comprende: