Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes.

La invención se refiere a un método para identificar células madre mesenquimales senescentes creciendo en cultivos in vitro,

que comprende: medir la longitud de los telómeros, determinar el nivel de ploidía en la célula, analizar la presencia de mitosis multipolares y analizar la expresión de los genes SCIN, AKAP9, EDN-1, CXCL1, CXCL12 y CD70 y, además, de los genes HIST1H4C, HIST1H4L, HIST1H1C, CENPM, DYNLT3, SPC25, GTSEl, CDC45L, PLKl y SKA3. Este método puede ser de utilidad para la realización de estudios de estabilidad genética en los cultivos de células madre mesenquimales cuyas células van a ser empleadas en terapia celular, lo que permite identificar y seleccionar aquellos más estables y apropiados para tal fin.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/ES2010/070534.

Solicitante: CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES (CNIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: BERNAD MIANA, ANTONIO, ESTRADA RODRIGUEZ,JUAN CAMILO, SAMPER RODRÍGUEZ,ENRIQUE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N5/0775 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células madre mesenquimales; Células madre derivadas de tejido adiposo.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/53 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G06F19/00

PDF original: ES-2445157_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes La presente invención se encuadra en el campo de la biología celular y la genética y hace referencia a un método para identificar células madre mesenquimales senescentes que se cultivan en cultivos in vitro, y comprende: medir la longitud de los telómeros en los cromosomas, determinar el nivel de ploidía en la célula, detectar la presencia de mitosis multipolar y analizar el nivel de expresión de los genes SCIN, AKAP9, EDN-1, CXCL1, CXCL12 y/o CD70. Este método puede ser de utilidad para la realización de estudios de estabilidad genética en los cultivos de células madre mesenquimales, lo que permite identificar y seleccionar las células más estables y apropiadas para ser utilizadas en la terapia celular.

Antecedentes de la invención Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) han sido propuestas en los últimos años como una poderosa herramienta en terapia celular por su elevado potencial para proliferar y diferenciarse en células derivadas del mesodermo (osteocitos, condrocitos y adipocitos) . Esta característica permite su uso en el tratamiento de algunas patologías asociadas con inflamación crónica, envejecimiento, enfermedades autoinmunes y patologías asociadas a traumas, tales como por ejemplo la enfermedad del injerto contra el huésped, las fístulas relacionadas con la enfermedad de Chron, la artritis reumatoide, el infarto de miocardio o condiciones degenerativas de cartílago y hueso.

No obstante, aunque existen fuentes de MSCs disponibles en diferentes tejidos, su cantidad en el cuerpo es escasa. La mayoría de los protocolos de terapia celular utilizan entre 10-50 millones de hMSCs por tratamiento, por lo que estas células necesitan ser expandidas en cultivos in vitro durante 4 a 8 semanas antes de su implantación. Además, estos cultivos con frecuencia se llevan a cabo en presencia de condiciones pre-oxidativas (20% de O2) y de concentraciones elevadas de suero y glucosa donde las células pueden sufrir mutaciones y aberraciones cromosómicas que ponen en peligro su bioseguridad si van a ser utilizadas en clínica. Estos largos períodos de cultivo y el daño oxidativo contribuyen a la senescencia celular y a la inestabilidad genética, lo que puede alterar las propiedades de las células, limitando su utilidad biomédica.

La senescencia está mediada principalmente por la activación de los genes supresores tumorales que detienen el ciclo celular, p15/p16/Rb y p19arf/p53/p21 (US2002123526 A1) . Además, las células senescentes sobreexpresan marcadores asociados al estrés como SA-β-galactosidasa o Lipofuscina (Krzysztof Ksiazek, 2009, Rejuvenation Research, Vol. 12, No. 2: 105-116) , así como programas que incrementan el nivel de citocinas pro-inflamatorias. Sin embargo, es necesaria la identificación de biomarcadores de senescencia más específicos para detectar el nivel de senescencia en los cultivos de células madre mesenquimales para la realización de controles de calidad antes de su aplicación biomédica.

Las células senescentes muestran cambios en algunos de sus parámetros fisiológicos y modifican las características de las células vecinas. La poliploidia (duplicaciones de todo el conjunto de cromosomas) constituye un marcador de estrés celular en la mayoría de los tejidos y se cree que es un mecanismo precursor de la aneuploidia, la cual se considera un factor fundamental asociado con el envejecimiento y con la transformación celular, ya que la mayoría de los tumores son aneuploides. Algunos autores han demostrado la presencia de aneuploidia en células madre mesenquimales que se originan en la médula ósea de primates no humanos, creciendo en cultivos (Reza Izadpanah, et al., 2008, Cancer Research, Vol. 68, No. 11: 4229-4238) . Por lo tanto, la aneuploidia ha sido propuesta como otra característica de las células senescentes (Steven R. Schwarze, et al., 2005, Neoplasia, Vol. 7, No. 9: 816–823) . Estudios previos han demostrado que durante el cultivo celular prolongado de las células madre embrionarias humanas existe una predisposición para el mantenimiento y la selección de aneuploidias cromosómicas específicas para los cromosomas 12, 17, X y 20q, que posiblemente proporcionan una ventaja selectiva para la propagación de las células madre embrionarias humanas que se mantienen indefinidamente en cultivo (Spits, C. et al., 2008, Nature Biotechnology, Vol. 26:1361-1363) .

Uno de los mecanismos principales para la inducción de senescencia en las células es el acortamiento de los telómeros. Los telómeros son los extremos terminales de los cromosomas eucariotas y son cruciales para mantener la estabilidad genética: el mantenimiento de la longitud y la función de los telómeros es un requisito para la división celular y para una correcta segregación cromosómica. Este proceso de mantenimiento en la mayoría de las células es realizado por la telomerasa transcriptasa inversa que añade repeticiones al final de los cromosomas. La senescencia de las células madre mesenquimales se ha asociado con un acortamiento progresivo de los extremos de los telómeros con ciclos de cultivo sucesivos (Melissa A. Baxter, et al., 2004, Stem Cells, 22:675–682) .

Otra de las aproximaciones investigadas para la detección de biomarcadores de senescencia en células madre mesenquimales en cultivo, es el análisis de la expresión genética de todo el transcriptoma de estas células para identificar aquellos genes que se expresan de manera diferente en las células senescentes y en las no senescentes.

Los genes identificados para su uso como biomarcadores de senescencia en su mayoría se encuentran relacionados con la proliferación celular, la respuesta a estrés, el desarrollo, el ciclo celular, la mitosis, la replicación y reparación del ADN, etc. (Eunsook Ryu, et al., 2008, Biochemical and Biophysical Research Communications, 371:431–436) .

Otros estudios basados en la identificación de biomarcadores de senescencia han investigado el impacto de la senescencia en el fenotipo, la diferenciación y los patrones de expresión génica global de las MSC que crecen en cultivo. Así, se ha asociado un acortamiento de los telómeros de los cromosomas y una expresión reducida de algunos de los genes implicados en la replicación y reparación del ADN con la senescencia en estas células (Wolfgang Wagner, et al., 2008, PLoS ONE, Vol. 3, No. 5) .

De manera que el acortamiento de los telómeros, la aneuploidia y los cambios en los patrones de expresión génica en comparación con las células no senescentes son características que han sido asociadas con el fenotipo senescente. No obstante, es necesario disponer de un método completo, que sea fiable y reproducible, que analice todos los parámetros implicados en el desarrollo de la senescencia, y que sea capaz de detectar células madre mesenquimales senescentes en cultivo. Este método permitirá el análisis de su estabilidad genética, lo cual es de especial relevancia, dadas las importantes aplicaciones de estas células en el campo de la terapia celular.

Descripción de la invención La presente invención proporciona un método para identificar células madre mesenquimales senescentes que crecen en cultivos in vitro, que comprende: medir la longitud media de los telómeros de los cromosomas, determinar el nivel de ploidía en la célula, analizar el número de mitosis multipolares y determinar el nivel de expresión de los genes SCIN (escinderina) , EDN-1 (endotelina-1) , AKAP9 (proteína de anclaje Kinasa A 9; Yotiao) , CXCL12, CXCL1 y CD70, implicados en el control de la ploidía y la poliploidización. Este método puede ser de utilidad para la realización de estudios de estabilidad genética en los cultivos de células madre mesenquimales, lo que permite la identificación y selección de las células más adecuadas y estables para ser utilizadas en terapia celular.

Los inventores han llevado a cabo un análisis de la expresión genética diferencial de células madre mesenquimales en el pase 21 y en el pase 2 de un cultivo en presencia de 20% de O2 para descubrir qué genes se expresan de manera diferente en las dos poblaciones y si esta diferencia en la expresión es significativa. Tras llevar a cabo un análisis para conocer qué genes de expresión alterada están implicados en procesos de inestabilidad genética, han demostrado que existen 69 genes modificados implicados en procesos de cáncer y del ciclo celular. De todos estos genes en los que la expresión se encuentra modificada en la senescencia, se seleccionaros un total de 8 con la expresión diferencial más significativa que están implicados en el mantenimiento del nivel de ploidía.

En base a este análisis, se llegó a la conclusión de que la senescencia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes que comprende:

a. medir la longitud de los telómeros de los cromosomas de la célula madre mesenquimal,

b. determinar el nivel de ploidía de la célula madre mesenquimal de la etapa (a) ,

c. analizar la presencia de mitosis multipolar en la célula madre mesenquimal de la etapa (b) ,

d. analizar el nivel de expresión de los genes SCIN, EDN-1, CXCL1, CXCL12 y CD70 en la célula madre mesenquimal de la etapa (c) , y

e. asociar los datos obtenidos en los pasos (a) - (d) con un fenotipo senescente.

2. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 1, en donde la medición de la longitud de los telómeros de los cromosomas de la etapa (a) se realiza mediante al menos uno de los siguientes métodos: FISH cuantitativo y/o TRAP.

3. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la determinación del nivel de ploidía de la etapa (b) se realiza mediante la hibridación con sondas cromosómicas específicas y un posterior recuento de su señal fluorescente.

4. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 3, en donde las sondas cromosómicas específicas son sondas CEP.

5. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 4, en donde las sondas CEP son específicas de los cromosomas 8, 10, 11 y/o 17.

6. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 5, en donde las sondas CEP son específicas del cromosoma 10.

7. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fenotipo senescente de la etapa (e) está caracterizado por mostrar:

a. una reducción en la longitud de los telómeros de los cromosomas en comparación con una célula no senescente,

b. aneuploidia,

c. mitosis multipolar,

d. una expresión elevada de los genes SCIN, y EDN-1, y

e. una expresión reducida de los genes CXCL1, CXCL12 y/o CD70.

8. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las células madre mesenquimales proceden de un humano.

9. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde además se analiza el nivel de expresión de los genes HIST1H4C, HIST1H4L, HIST1H1C, CENPM, DYNLT3, SPC25, GTSE1, CDC45L, PLK1 y SKA3 en la célula madre mesenquimal, y se asocian los datos obtenidos con un fenotipo senescente.

10. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 9, en donde el fenotipo senescente se caracteriza por mostrar:

a. una expresión elevada de los genes HIST1H1C y DYNLT3, y

b. una expresión reducida de los genes HIST1H4C, HIST1H4L, CENPM, SPC25, GTSE1, CDC45L, PLK1 y SKA3.

11. Kit para la identificación de células madre mesenquimales senescentes que comprende: sondas telómeras PNA, sondas CEP y sondas Taqman que son específicas para los genes SCIN, EDN-1, CXCL1, CXCL12 y CD70.

12. Kit para la identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 11, en donde las sondas CEP son específicas de los cromosomas 8, 10, 11 y/o 17.

13. Kit para la identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, que además comprende sondas PNA, sondas CEP y sondas Taqman específicas para los genes HIST1H4C, HIST1H4L, HIST1H1C, CENPM, DYNLT3, SPC25, GTSE1, CDC45L, PLK1 y SKA3.


 

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