Método para la gelificación de fibroína de seda usando sonicación.

Un procedimiento para formar rápidamente gelificación de fibroína de seda,

que comprende exponer fibroína de seda a un tratamiento que comprende ultrasonicación durante un periodo de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 60 segundos para iniciar la gelificación, en donde se forma gelificación sustancial de la fibroína de seda menos que 24 horas después del tratamiento de ultrasonicación.

Método para la gelificación de fibroína de seda usando sonicación Campo de la invención

Esta invención proporciona métodos para formar rápidamente gelificación de fibroína de seda mediante ultrasonicación. Los hidrogeles formados a partir del método son útiles, por ejemplo, como vehículos de bioentrega.

Antecedentes

Los hidrogeles poliméricos biocompatibles y biodegradables son vehículos útiles para entregar moléculas bioactivas y células para aplicaciones biomédicas, tal como en ingeniería de tejidos y liberación controlada de fármacos. La fibroína de seda nativa purificada forma estructuras de hidrogel reticuladas ricas en láminas (3 a partir de una disolución acuosa, siendo los detalles del proceso y las propiedades del gel influenciados por parámetros del entorno. Los tiempos de gelificación previos a menudo llevan días a semanas para disoluciones acuosas de proteínas de seda nativas, siendo la alta temperatura y bajo pH responsables de aumentar la cinética de la gelificación. Esas condiciones, aunque adecuadas para la incorporación de algunas moléculas bioactivas, pueden ser demasiado lentas para la incorporación de células activas y moléculas bioactivas lábiles.

Por tanto, hay una necesidad en la técnica de un procedimiento para formar rápidamente gelificación de fibroína de seda en condiciones fisiológicas suaves.

Compendio de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para formar rápidamente gelificación de fibroína de seda. El procedimiento expone fibroína de seda a un tratamiento que comprende ultrasonicación durante un periodo de tiempo suficiente para iniciar la gelificación. Por ejemplo, bajo condiciones particulares, la gelificación se produce dentro de 24 horas del tratamiento de ultrasonicación.

Una realización de la invención también se refiere a un método para controlar el tiempo de gelificación de la fibroína de seda poniendo en contacto una disolución de fibroína de seda con un tratamiento de ultrasonicación durante un periodo de tiempo suficiente para iniciar la gelificación. En un ejemplo, el tiempo de gelificación está por debajo de dos horas.

Otra realización se refiere a un método para encapsular un agente en fibroína de seda. El método comprende exponer una disolución de fibroína de seda a un tratamiento de ultrasonicación durante un periodo de tiempo para iniciar la gelificación, e introducir el agente en la disolución de fibroína de seda antes de que se produzca una gelificación sustancial en la disolución de fibroína de seda, formando de este modo un agente encapsulado en la fibroína de seda. Alternativamente, el agente se puede añadir a la fibroína de seda antes de la sonicación. El agente puede ser un agente terapéutico, tal como un fármaco, o un material biológico, tal como una célula. Por ejemplo, se incorporaron con éxito células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana (hMSCs) en hidrogeles de fibroína de seda después de la sonicación, seguido de gelificación rápida y función celular sostenida.

Los hidrogeles que resultan de los métodos de la invención exhiben tanto buenas propiedades mecánicas como perfiles de degradación proteolítica. Por ejemplo, disoluciones a 4%, 8% y 12% (p/v) de fibroína de seda sonicadas, seguido de añadir hMSCs, se gelificaron en ,5 horas a 2 horas. Las células crecieron y proliferaron en los geles al 4% a lo largo de veintiún días. Adicionalmente, se pueden usar concentraciones de K+ bajas y pH bajo para promover la gelificación.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la gelificación de fibroína de seda (FS) bajo diversas condiciones de sonicación. Se usaron ,5 mi de disolución acuosa, la sonicación se realizó a 2% de amplitud y el tiempo varió de 5 s a 3 s. Los valores son media ± desviación estándar de un mínimo de N = 3 muestras para cada grupo. * Diferencias significativas entre los grupos (test t de Student, p<,1).

Las Figuras 2A-2C representan la formación dinámica de la estructura de láminas (3 de la seda durante el proceso de gelificación. La Fig. 2A muestra medidas de Dicroísmo Circular (DC) en disoluciones acuosas de fibroína de seda al 2% (p/v) sonicadas, con barridos de longitudes de onda tomados cada 8 min después de la sonicación durante 12 min. La Fig. 2B muestra una gráfica del aumento de la elipticidad a 217 nm (pico de estructura de láminas (3) registrado frente al tiempo. La Fig. 2C es una ilustración esquemática del mecanismo de gelificación de la seda. El proceso de gelificación contiene dos etapas cinéticas, (a) cambio estructural de espiral aleatoria a lámina (3, produciéndose algunas reticulaciones físicas inter-cadena en un marco de tiempo corto; (b) estructura de láminas (3 extendida, gran cantidad de reticulaciones de lámina (3 inter-cadena formadas, y moléculas organizadas hasta una red de gel a lo largo de un marco de tiempo relativamente largo.

Las Figuras 3A-3C muestran los efectos de la sal y el pH sobre la gelificación de fibroína de seda. Antes de la sonicación, se suplementaron disoluciones a diversas concentraciones con K+ (Fig. 3A) y Ca2+ (Fig. 3B) hasta

concentraciones finales de 2 mM-2 mM. La Fig. 3C muestra los efectos de ajustar el pH de la disolución acuosa de fibroína de seda antes de la sonicación. La sonicación se realizó a 2% de amplitud durante 15 s para todas las muestras. Los valores son media ± desviación estándar de un mínimo de N = 3 muestras para cada grupo. *, Diferencias significativas entre los grupos (test t de Student, p<,5).

Las Figuras 4A-4C presentan gráficas que analizan las propiedades mecánicas de hldrogeles de fibroína de seda. La Figura 4A representa el límite elástico (kPa) de geles de fibroína de seda (eje y) a concentraciones vahadas, 4%, 8% y 12% (eje x) bajo condiciones de 3 Amp, 4 Amp o 5 Amp. La Figura 4B representa el módulo elástico tradicional (kPa) de geles de fibroína de seda (eje y) a concentraciones vahadas, 4%, 8% y 12% (eje x) bajo condiciones de 3 Amp, 4 Amp o 5 Amp. La Figura 4C representa el módulo de equilibrio (kPa) de geles de fibroína de seda (eje y) a concentraciones variadas, 4%, 8% y 12% (eje x).

La Figura 5 representa la degradación enzimática de hldrogeles de fibroína de seda. Se prepararon por sonicación hidrogeles a 4%, 8% y 12% (p/v) y se sumergieron en PBS, pH 7,4 (control) o bien proteasa XIV en PBS (5 U/ml) durante siete días. La masa que quedó se determinó comparando el peso húmedo de trozos de gel en cada punto de tiempo con el peso húmedo original. Los valores son media ± desviación estándar de un mínimo de N = 4 muestras.

La Figura 6 representa gráficamente la cuantificación de ADN de hMSCs encapsuladas en hidrogeles de fibroína de seda. El contenido de ADN en cada grupo de gel se analizó con el ensayo PIcoGreen, y los resultados se normalizaron mediante el peso húmedo de cada trozo de gel. Los valores son media ± desviación estándar de un mínimo de N = 4 muestras. * Diferencias significativas entre los grupos (test t de Student, p<,5).

Descripción detallada

Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, y reactivos, etc. particulares descritos en la presente memoria, y como tal pueden variar. La terminología empleada en la presente memoria es para el fin de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que es definida únicamente por las reivindicaciones.

Como se emplean en la presente memoria y en las reivindicaciones, las formas singulares incluyen la referencia plural y viceversa, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aparte de en los ejemplos de operación, o donde se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción empleados en la presente memoria deben entenderse como modificados en todos los casos por el término

"aproximadamente".

Todas las patentes y otras publicaciones identificadas se incorporan expresamente en la presente memoria por referencia para el fin de describir y revelar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que se podrían usar en conexión con la presente Invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe ser Interpretado como una admisión de que los Inventores no están autorizados a anteceder tal descripción en virtud de invención anterior o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a las fechas o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos están basadas en la información disponible... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para formar rápidamente gelificación de fibroína de seda, que comprende exponer fibroma de seda a un tratamiento que comprende ultrasonicación durante un periodo de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 6 segundos para iniciar la gelificación, en donde se forma gelificación sustancial de la fibroína de seda menos que 24 horas después del tratamiento de ultrasonicación.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la gelificación de la fibroína de seda se forma menos que 2 horas después del tratamiento de ultrasonicación.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la fibroína de seda sufre gelificación en un periodo de tiempo que varía de aproximadamente cinco minutos a aproximadamente dos horas después del tratamiento de ultrasonicación.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde el tratamiento comprende además una disolución salina, en donde la disolución salina comprende opcionalmente iones seleccionados del grupo que consiste en potasio, calcio, sodio, magnesio, cobre, cinc y combinaciones de los mismos.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la fibroína de seda está en la forma de una disolución acuosa que tiene un pH que es aproximadamente pH 4 o inferior o es aproximadamente pH 7,5 o superior.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde la sal es potasio, la concentración salina es menos que 1 mM, y el pH de la disolución salina es aproximadamente pH 4 o inferior.

7. Un método para controlar el tiempo de gelificación de fibroína de seda empleando un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la fibroína de seda sufre gelificación sustancial en aproximadamente dos horas.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el tiempo de gelificación es controlado mediante la amplitud de la ultrasonicación y la concentración de la disolución de fibroína de seda.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde el tiempo de gelificación es controlado mediante la concentración de la disolución de fibroína de seda y la concentración de la disolución salina, y opcionalmente,

en donde la concentración de la fibroína de seda es 4% en peso o inferior, la disolución salina comprende iones potasio, y la concentración de la disolución salina de potasio varía de 2 mM a 1 mM.

1. El método de la reivindicación 7, en donde el tiempo de gelificación es controlado mediante la concentración y el pH de la disolución salina, y opcionalmente,

en donde la disolución salina comprende iones potasio, la concentración de la disolución salina de potasio varía de 2 mM a 1 mM, y el pH de la disolución es pH 4 o inferior.

11. Un método para encapsular al menos un agente en fibroína de seda, que comprende:

poner en contacto una disolución de fibroína de seda con un tratamiento de ultrasonicación durante un periodo de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 6 segundos para iniciar la gelificación; y

introducir el (los) agente(s) en la disolución de fibroína de seda antes de que se produzca gelificación sustancial en la disolución de fibroína de seda;

para formar un agente encapsulado en fibroína de seda.

12. Un método para encapsular al menos un agente en fibroína de seda, que comprende: introducir el (los) agente(s) en una disolución de fibroína de seda; y

poner en contacto una disolución de fibroína de seda con un tratamiento de ultrasonicación durante un periodo de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 6 segundos para iniciar la gelificación;

para formar un agente encapsulado en fibroína de seda.

13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde el agente es un agente terapéutico o un material biológico, o ambos, y/o

en donde el agente es al menos un material biológico seleccionado del grupo que consiste en células, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, APN, aptámeros, anticuerpos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas, enzimas, compuestos antimicrobianos, y combinaciones de los mismos, y/o

en donde dicha célula es una célula madre no embrionaria, y/o

en donde se introduce un medio de cultivo celular en la fibroma de seda con el material biológico, y/o

en donde el agente es un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en moléculas pequeñas, fármacos, y combinaciones de los mismos.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde se produce gelificación sustancial en aproximadamente 2 5 horas, y/o

en donde se produce gelificación sustancial en el periodo de tiempo que varía de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas, y/o

en donde el tratamiento comprende además una disolución salina, y/o

en donde la fibroína de seda está en la forma de una disolución acuosa que tiene un pH que es aproximadamente 1 pH 4 o inferior o es aproximadamente pH 7,5 o superior.

15. Un material biológico encapsulado en fibroína de seda obtenible por un método de la reivindicación 12 y 13, para uso como dispositivo de bioentrega.