MÉTODO PARA EVALUAR LA INTEGRIDAD DE LA PARED CELULAR BACTERIANA.

Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.

La presente invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, que desde un punto vista práctico, permite determinar de forma rápida si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana. Asimismo, la presente invención también se relaciona con una solución de lisis de aplicación en el método anterior, que afecta de forma específica a las bacterias que presentan la pared celular dañada por la acción de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, permitiendo distinguir las bacterias sensibles de las resistentes a dicho antibiótico.

Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica, y principalmente aquel relacionado con la microbiología, cuyo ámbito de aplicación se encuentra dentro del sector sanitario (humano, veterinario, medioambiental y básico) . La presente invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, que desde un punto vista práctico, permite determinar de forma rápida si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos.

Algunos de los métodos más usados en la práctica clínica diaria incluyen (i) métodos de difusión, como el antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores (Bauer A W, et.al. Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45:493-496) o el método épsilon test o E-test (AB Biodisk, Suecia) , o (ii) métodos de dilución, como el método de dilución en agar o el método de microdilución con caldo. Comparando los métodos de difusión con los métodos de dilución, éstos son técnicamente más complejos y casi siempre más caros, en particular cuando se utilizan paneles comerciales de microdilución. En la práctica rutinaria del laboratorio de microbiología clínica, los métodos de microdilución en medio líquido son los más utilizados.

En muchos laboratorios el empleo de paneles comerciales se basa en la utilización de sistemas semiautomáticos de incubación-lectura-interpretación; esto facilita su uso, pero tiene el inconveniente del incremento del gasto. Algunas compañías han introducido en el mercado paneles en los que el medio de cultivo incluye un indicador fluorescente que permite la obtención rápida (menos de 8 horas) de los resultados. En relación con determinación rápida de resistencia a antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana, como los º-lactámicos, se añade un compuesto metabolizable fluorogénico al medio de cultivo (solicitud de patente WO/1992/019763) . Si el organismo crece con el antibiótico, el metabolismo de la bacteria da lugar a la suelta del fluoróforo. Si el organismo no crece, se incrementa la fluorescencia de la muestra.

Otra posibilidad es usar un compuesto indicador de color, como el tetrazolium, que en caso de sensibilidad al antibiótico produce un cambio de color tras añadir un transportador electrónico como la phenazine methosulfate. Sin embargo, no existen aún datos suficientes que permitan aconsejar el uso rutinario de este tipo de paneles.

Varias compañías comerciales están evaluando, también, sistemas expertos (programas informáticos) que facilitan la interpretación clínica de los resultados obtenidos; es presumible que su uso se generalizará en un futuro. Varios sistemas se encuentran a fecha de hoy en el mercado, MicroScan WalkAway, Vitek, Wider entre los más destacados. A falta de más experiencia clínica con el empleo de indicadores fluorescentes el tiempo medio de respuesta para obtener la susceptibilidad a antimicrobianos de un microorganismo específico oscila, como en los métodos de difusión previamente mencionados, entre 18 a 24 horas.

Recientemente se ha apuntado la posibilidad de emplear un sistema de dielectroforesis que detecta cambios en la electrofisiología de la célula tras administrar el antibiótico (Hoettges KF, Dale JW, Hughes MP. Rapid determination of antibiotic resistance in E. coli using dielectrophoresis. Phys Med Biol 2007;52:6001-6009) .

Otro desarrollo para antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana, como los º-lactámicos, consiste en la detección, mediante un sustrato específico, de la actividad de enzimas citoplásmicas que son liberadas por la célula al medio, si el antibiótico ha sido efectivo (European Patent EP0135023) .

El BACcelr8r™ es una plataforma en desarrollo por Accelr8, para la identificación automática de microorganismos y estudiar su resistencia a antibióticos. No emplea cultivo ni hace necesario el aislamiento de las bacterias. Funciona mediante cassettes, en donde cada una corresponde a una muestra. Usa un sistema automatizado, con un microscopio controlado mediante un computador, una cámara digital y un software de análisis. Una bomba mantiene un flujo de medio con bacterias, en diferentes condiciones, a través de la cassette. El análisis de la resistencia a antibióticos podría completarse en 8 horas.

La solicitud de patente US2004/0014066 describe un método para detectar en una muestra la actividad de un antibiótico que afecta la integridad celular que comprende (a) proporcionar un microorganismo transformado que comprende una ácido nucleico que codifica un promotor operativametne unido a un gen reportero heterólogo capaz de emitir una señal detectable, y (b) contactar la muestra con el microorganismo trasformado, (c) observar dicho microorganismo para dicha señal detectable, en el que el promotor está regulado por un sistema de transducción de señales de dos componentes, en donde los componentes son (i) un receptor sensible a cambios en la envuelta o membrana celular del microorganismo y (ii) un factor que actúa en trans que es activado en repuesta a una estimulación por el receptor y que regula el promotor.

Antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana El esqueleto de la pared celular bacteriana está constituido por un heteropolímero, el peptidoglicano mureína. Esta macromolécula está formada por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina (NAG) y el ácido Nacetilmurámico (NAM) unidos mediante enlaces ß-1, 4. La cadena es recta y no ramificada, constituyendo la estructura básica de la pared celular. El ácido N-acetilmurámico posee un grupo de ácido láctico que enlaza con una pequeña cadena peptídica (tetrapéptido) . Entre los aminoácidos típicos de esta cadena se encuentran la L-alanina, ácido D-glutámico, ácido m-diaminopimélico o la L-lisina o D-alanina.

Los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared bacteriana son distintas familias de fármacos que actúan sobre distintos pasos de la síntesis de la pared bacteriana:

-La cicloserina es un análogo de la D-alanina e inhibe competitivamente la unión de este aminoácido a las enzimas D-alanino-D-alanina sintetasa y la alanino racemasa, impidiendo su unión a los precursores del peptidoglicano.

-La fosfomicina bloquea la síntesis de los precursores del péptidoglicano. -La bacitracina inhibe el reciclado del undecaprenil, el transportador lipídico del peptidoglucano hacia el exterior de la célula.

-Los antibióticos glucopéptidos o glicopéptidos son una clase de péptidos que contienen azúcares ligados, como en la pared celular bacteriana, poseyendo una gran afinidad a los precursores de esta estructura. Los más conocidos son la vancomicina y la teicoplanina. La vancomicina ejerce su acción bactericida inhibiendo la síntesis de la pared celular bacteriana, uniéndose al fragmento D alanina-D alanina (D-Ala-D-Ala) del pentapéptido de la pared de las bacterias Gram+, bloqueando la incorporación de péptidos a la pared celular. Secundariamente, la vancomicina actuaría por otros mecanismos como es la afectación de la permeabilidad de la membrana citoplasmática e inhibición de la síntesis de ARN, que se ejerce después que el fármaco se unió al peptidoglicano.

-Los antibióticos º-lactámicos ejercen función bactericida al interferir la unión transversal o puente interpeptídico, necesario para la reticulación. Inhiben la actividad de las PBPs, serina proteasas o transpeptidasas, con las que se unen de forma irreversible.

-Otros antibióticos que interfieren con la síntesis de pared son isoniacida, etionamida y el etambutol. Se usan en el tratamiento de infecciones por micobacterias, al igual que la cicloserina, citada anteriormente. La isoniacida tiene actividad bactericida en fase de replicación activa. Afecta síntesis de ácido micólico, interrumpiendo la elongación de ácidos grasos. La etionamida también inhibe síntesis de ácido micólico. El etambutol interfiere la síntesis de arabinogalactano de la pared celular. La resistencia a estos antibióticos es por la falta de penetración en la bacteria y/o modificación... [Seguir leyendo]

1. Método para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende: i) añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y

ii) determinar la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo, en el que la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo es indicativo de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende entre las etapas (i) e (ii) , inmovilizar una muestra del cultivo de la etapa (i) sobre un portaobjetos.

3. Método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende:

i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, ii) añadir solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i) , en donde dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11, 5, y

iii) determinar la presencia del nucleoide bacteriano, en el que la presencia del nucleoide bacteriano en el medio es indicativa de que la integridad de la pared celular de las bacterias ha sido dañada.

4. Método según la reivindicación 3, en el que las bacterias presentes en el cultivo pertenecen a la misma especie o a especies distintas.

5. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende, además, hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.

7. Método según la reivindicación 5, en el que el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en el toctilfenoxipolietoxietanol, N, N-Bis (3-D-gluconamidopropil) colamida, tricosaetilen gliol dodecileter, N-decanoil-Nmetilglutamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglucamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxi poli (etileneoxi) etanol ramificado, N-Nonanoil-N-metilglucamina, octilfenoxipolietoxietanol, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la solución de lisis comprende, además, hasta una concentración 3M de una sal.

9. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil) -1, 3-propanediol 0, 2M, dodecilsulfato de sodio 0, 025%, cloruro sódico 0, 5M ó 0, 05M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

10. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil) -1, 3-propanediol 0, 2M, Triton X-100 5%, cloruro sódico 1M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

11. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende sodio fosfato bibásico 0, 3M, dodecilsulfato de sodio 2%, ácido etilendiamino tetraacético 0, 05M, un pH de 11, 45 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que el método comprende, además, antes o después de la etapa (ii) , inmovilizar una muestra del cultivo sobre un portaobjetos.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la observación de la presencia de fragmentos extracelulares de ADN o del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo se lleva a cabo mediante tinción.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la tinción se lleva a cabo mediante fluorocromos.

15. Método según la reivindicación 14, en el que los fluorocromos se seleccionan del grupo que consiste en Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, cromomicina A3, mitramicina, bromuro de etidio, naranja de acridina, naranja de

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tiazoilo, , 7-AAD, , derivados de la cianinas, y las variantes de los fluorocromos TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO y LO-PRO.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico º-lactámico, una isoniacida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido.

17. Método según la reivindicación 16, en el que el antibiótico º-lactámico se selecciona del grupo que consiste en penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbacefem, carbapenémicos, monobactámicos e inhibidores de las lactamasas.

18. Método según la reivindicación 17, en el que los inhibidores de las º-lactamasas se seleccionan del grupo que consiste en ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.

19. Método según la reivindicación 16, en el que el antibiótico glucopéptido es vancomicina o teicoplanina.

20. Método para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico.

21. Método para diseñar una terapia antibiótica personalizada a un individuo que padece una enfermedad bacteriana que comprende i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 19, en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo es susceptible de recibir una terapia basada en un antibiótico que actúan a nivel de la pared celular.

22. Método para identificar un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende: i) poner en contacto un cultivo de una bacteria sensible a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en presencia del compuesto candidato, y ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto candidato es un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana.

23. Método para identificar una bacteria persister o tolerante a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en un cultivo de bacterias sensibles, que comprende evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en dicho cultivo mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 19, en el que la bacteria cuya integridad de la pared celular no haya sido dañada es identificada como persister o tolerante.

24. Una solución de lisis caracterizada porque afecta solo a las bacterias que presentan la pared bacteriana dañada por acción de un antibiótico, que comprende un tampón y un pH de entre 3 y 11, 5.

25. Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que dicha solución de lisis comprende, además, hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico

26. Solución de lisis según la reivindicación 25, en el que el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.

27. Solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 25, en el que el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en el toctilfenoxipolietoxietanol, N, N-Bis (3-D-gluconamidopropil) colamida, Brij (r) 35 P, Ndecanoil-N-metilglutamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglutamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxi poli (etileneoxi) etanol ramificado, N-Nonanoil-N-metilglutamina, Nonidet P 40, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

28. Solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que la solución de lisis comprende, además, hasta una concentración 3M de una sal.

29. Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil) -1, 3propanediol 0, 2M, dodecilsulfato de sodio 0, 025%, cloruro sódico 0, 5M ó 0, 05M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

30. Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil) -1, 3propanediol 0, 2M, Triton X-100 5%, cloruro sódico 1M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

31. Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que la solución de lisis comprende sodio fosfato bibásico 0, 3M,

dodecilsulfato de sodio 2%, ácido etilendiamino tetraacético 0, 05M, un pH de 11, 45 y temperatura ambiente de 22ºC 10 ó 37ºC.

32. Uso de una solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, para evaluar la integridad de pared celular bacteriana.

33. Kit que comprende una solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31.

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