Método espectroscópico para la determinación de proteínas en medios complejos.

Método espectroscópico para la determinación de proteínas en medios complejos.

La presente invención se refiere a un método determinación cuantitativa de dos proteínas con características similares en una muestra, basado en medidas espectroscópicas de fluorescencia y absorción en UV. Este método permite obtener la concentración de las proteínas de una forma sencilla y rápida evitando la destrucción de la muestra, y es útil en los sectores biotecnológico o alimentario.

Método espectroscópico para la determinación de proteínas en medios

complejos

La presente invención se refiere a un método de determinación cuantitativa de una mezcla de dos proteínas en una muestra, basado en medidas espectroscópicas de fluorescencia y absorción en la región ultravioleta- visible (UV-Vis). Este método es aplicable principalmente en el sector en el sector alimentario y en procesos biotecnológicos donde la separación y valorización de proteínas precisa su determinación cuantitativa.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En la naturaleza existen moléculas con un alto interés comercial debido a sus propiedades farmacéuticas y nutracéuticas como son las proteínas del suero lácteo. Éstas se encuentran siempre en medios complejos y en muchos casos presentan características similares, por lo que su separación y posterior cuantificación resulta complicada.

Las técnicas para la cuantificación de proteínas pueden dividirse en dos tipos:

Técnicas para la determinación de la concentración total de proteínas, tales como los métodos Kjeldahl, Sorensen-Walker, la reacción Folin- Ciocalteau, espectrofotometría UV-Vis, refractometría, técnicas turbidimétricas y nefelométricas, método Bradford, Lowry o de fijación de colorante (BCA).

Técnicas para la detección individual de proteínas: electroforesis, cromatografía y técnicas de inmunoensayo (ELISA).

Aunque existen propuestas en la bibliografía para la determinación de proteínas del suero lácteo tanto de manera total como individual, hasta la fecha ninguna de ellas permite obtener resultados fiables cuando se trata de proteínas con contenidos en aminoácidos similares, así como tamaños y

propiedades poco diferenciables que implican la imposibilidad de su medida mediante la lectura simple de los espectros de absorción o en su aislamiento por tamaño.

Los métodos para la determinación de la concentración total de proteínas se basan en aproximaciones del contenido proteico total al de una proteína modelo, la albúmina de suero bovino (BSA), dando valores de concentración que difieren en muchos casos de la realidad, ya que las proteínas diferenciadas presentan valores distintos de absorbancia para una misma concentración, posiblemente debido a efectos de agregación.

Algunos métodos para la determinación de proteínas en leche han sido descrito en los siguientes documentos: Rukke, E. O., et al. Journal of Dairy Science 93.7 (2010): 2922-2925: Comparing calibration methods for determination of protein in goat milk by ultraviolet spectroscopy, donde se determina la concentración proteica total basada en la cuarta derivada de los espectros de absorción; sin embargo, estas medidas se hacen en base a una proteína modelo, difiriendo los valores de absorción con respecto a las proteínas reales en algunos casos con incertidumbres superiores al 30%. En el artículo publicado por Bogomolov A., and Melenteva A. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 126 (2013): 129-139 titulado Scatter-based quantitative spectroscopic analysis of milk fat and total protein in the región 400-1100 nm in the presence of fat globule size variability, se realiza un análisis espectroscopia) cuantitativo basado en la dispersión de grasa y proteína total en la región de 400-1100 nm en presencia de glóbulos de grasa de tamaño variable. De igual modo aproxima el valor de proteína total a estándares cuya concentración puede diferir de la real y, por tanto, de la absorbancia real.

Los métodos de determinación de la concentración total de proteínas (Kjeldahl y absorción, fundamentalmente) sólo pueden determinar

aproximaciones en la concentración de proteínas cuando se encuentran en mezclas que toman como referencia una proteína modelo.

Por otra parte, los métodos para la determinación individual de proteínas son costosos, lentos, destructivos y no aplicables a medios complejos ya que son muy sensibles a las interferencias. Un ejemplo de estas interferencias puede ser la presencia de sales que forman iones simples mucho más afines a las columnas basadas en intercambio iónico u otras proteínas de características similares que pueden tener bandas de absorción en el mismo rango espectral.

Tal y como se acaba de describir se puede concluir que, los métodos disponibles para la medida de proteínas lácteas presentan grandes inconvenientes. Con respecto a las técnicas de determinación individual como son las de inmunoensayo, a pesar de ser muy sensibles, tienen un elevado coste, ya que para su medida es necesario el uso de un kit que no puede ser usado más de una vez. Por otro lado, los ligandos específicos tienen muchas limitaciones en cuanto al medio en que están presentes, siendo la presencia de tensioactivos, así como de otras proteínas similares una interferencia importante; por otra parte, el color producido por la unión se desvanece con el tiempo.

Las técnicas electroforéticas, a pesar de que se ha producido una mejora de las mismas respecto a su velocidad, automatización y reproducibilidad, al estar basadas en el tamaño y movilidad electroforética de las proteínas no permiten distinguir proteínas similares, siguen teniendo limitaciones en la sensibilidad y reproducibilidad, especialmente debido a la interferencia de otras sustancias que puedan estar presentes en el medio.

Las técnicas cromatográficas (cromatografía líquida) son caras debido al uso de columnas con baja vida útil y presentan el gran inconveniente de la alta generación de residuos. De igual modo, el medio juega un papel importante

en estas medidas no siendo posible la medida en medios con alto contenido salino.

En el caso de los métodos de fluorescencia aplicados hasta el momento, éstos se basaban en ligar la proteína a una sustancia fluorescente pero este proceso es laborioso, destructivo y caro, y en general no tiene en cuenta efectos de agregación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención resuelve los inconvenientes que presentan los métodos de cuantificación de proteínas disponibles hasta el momento y presenta un método de medida de dos proteínas de características similares en un medio electrolítico mediante la combinación de las medidas de los espectros de fluorescencia fotoestimulada y de absorción en el rango ultravioleta. Se trata de una medida no destructiva, rápida, fiable, y en la que se reducen los costes de operación significativamente. Además, es un método en el que no se generan residuos.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la determinación cuantitativa de una mezcla de dos proteínas en una muestra biológica aislada que comprende:

i. Realizar la calibración de la intensidad y posición de las bandas de fluorescencia y absorción ultravioleta con muestras patrones de concentración de cada una de las proteínas a determinar y de sus muestras en medio electrolítico y con el pH fijado entre 3-9 mediante el empleo de cubetas de cuarzo;

ii. Medir el espectro de excitación de fluorescencia en la longitud máxima de emisión de la proteína para obtener curvas de intensidad en fluorescencia vs. longitud de onda;

iii. Determinar la posición del centro de la banda de fluorescencia vs. al número de onda para las proteínas individuales y sus mezclas y realizar el calibrado de la posición en función del porcentaje de una de ellas;

iv. Medir el espectro de absorción en el rango azul-ultravioleta de las proteínas individuales y sus mezclas para obtener los espectros de absorción en ultravioleta vs. al número de onda;

VI.

Determinar la concentración de las proteínas en la muestra mediante el ajuste del perfil a la contribución de gaussianas libres y fijas que describan los perfiles de absorción ultravioleta-visible, coincidiendo en posición y anchura una de las gaussianas fijas para ambas proteínas. El número de gaussianas necesarias para cada proteína se determinará en el proceso de ajuste de los espectros permaneciendo el número constante a lo largo de las mediciones;

Determinar las curvas de intensidad de absorción dada por la altura de la gaussiana común frente a la concentración en función del porcentaje de proteína y realizar una curva de calibrado pendiente de la recta frente al porcentaje de proteína;

vii. Medir los espectros de excitación y absorción ultravioleta de la

muestra problema;

viii. Determinar la posición de la banda de excitación y con la recta de

calibración el porcentaje de una de las proteínas;

ix. Determinar la altura de la gaussiana común en los ajustes de la curva de absorción ultravioleta y con el valor de la pendiente de la curva de calibración...

1. Método para la determinación cuantitativa de una mezcla de dos proteínas en una muestra biológica aislada que comprende:

i. realizar un calibrado de la intensidad y posición de las bandas de fluorescencia y de absorción ultravioleta con muestras patrones de concentración de cada una de las proteínas a determinar y de sus muestras en medio electrolítico a pH fijo entre 3 y 9;

ii. medir el espectro de excitación de fluorescencia en la longitud máxima de emisión de la proteína para obtener curvas de intensidad en fluorescencia vs. al número de onda;

iii. determinar la posición del centro de la banda de fluorescencia vs. el número de onda para las proteínas individuales y sus mezclas y realizar en calibrado de la posición en función del porcentaje de una de ellas;

iv. medir el espectro de absorción en la región azul-ultravioleta de las proteínas individuales y sus mezclas para obtener los espectros de absorción en ultravioleta vs. el número de onda;

v. determinar la concentración de las proteínas en la muestra mediante el ajuste del perfil a la contribución de gaussianas libres y fijas que lo describen los perfiles de ultravioleta-visible, coincidiendo en posición y ancho una de las gaussianas fijas para ambas proteínas;

vi. determinar las curvas de intensidad de absorción dada por la altura de la gaussiana común frente a la concentración en función del porcentaje de proteína y realizar una curva de calibrado pendiente de la recta frente al porcentaje de proteína;

vii. medir los espectros de excitación y absorción ultravioleta de la muestra problema;

viii. determinar la posición de la banda de excitación y con la recta de calibración el porcentaje de una de las proteínas.

ix. determinar la altura de la gaussiana común en los ajustes de la curva de absorción ultravioleta y con el valor de la pendiente de la curva de calibración determinar la concentración total.

2. Método según la reivindicación 1, donde las proteínas a determinar son de origen lácteo.

3. Método según la reivindicación 2, donde las proteínas se seleccionan de

entre albúmina de suero, lactoferrina, albúmina de suero bovino,

lactoalbúmina, lactoglobulina.