Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Yersinia, en muestras fecales.

Dispositivo inmunocromatográfico, y método para su uso que, mediante la aplicación de una muestra de heces o cultivo de enriquecimiento permite la detección simultanea y diferenciada de los antígenos O:3 y O:9 de la bacteria Yersinia enterocolítica mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa

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Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201231025.

Solicitante: CERTEST BIOTEC, S.L..

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: LANDETA ELORZ,OSCAR, VELASCO MICHELENA,Beatriz, GUSTAVO ASÍN,Carlos, GARCÍA MIGUEL,Yolanda.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/569 (para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus)
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Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Yersinia, en muestras fecales.

Fragmento de la descripción:

Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Yersinia, en

muestras fecales Campo de la invención La presente invención se encuadra dentro del área de microbiología y biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades causadas por Yersinia. El objeto de la invención es un procedimiento rápido y sencillo de detección de los serotipos 0:3 y 0:9 de la bacteria Yersinia enteroco/ítica (Y. enterocolítica) .

Estado de la técnica

Yersinia enterocoJítica es una especie anaeróbica facultativa, gram-negativa y oxidasa negativa. Y. enterocolítica es altamente heterogénea y puede clasificarse dentro de varios serotipos, de los cuales sólo unos pocos han sido asociados con enfermedad en humanos. Se han descrito seis diferentes biotipos (biotipo lA, lB, 2-5) Y numerosos serotipos de Y. enterocolítica. Once de esos serotipos se han asociado con mayor frecuencia con infecciones en humanos. La mayoría de las cepas de Y. enterocolítica que se asocian con la yersiniosis humana pertenecen a los serotipos 0:9 y 0:3.

Yersinia enterolocolítica es un patógeno relativamente común tanto en humanos como en animales. La infección provocada por Y. enterocolítica puede provocar, dependiendo de la edad de la persona infectada, gran variedad de síntomas. El síntoma clínico predominante es dolor abdominal y diarrea con o sin presencia de fiebre. Existen otras complicaciones como artritis y eritema nodoso. A menudo esta infección por Y. enterocolítica ocurre en niños pequeños. Los síntomas más comunes son fiebre, dolor abdominal y diarrea, a menudo sanguinolenta. Estos síntomas se desarrollan entre 4 y 7 días tras exposición y pueden durar hasta 1 o 3 semanas o incluso más. Hay cierta evidencia indirecta de que los alimentos, particularmente productos derivados del cerdo, son una fuente importante de la infección en humanos.

Problema a resolver

Tradicionalmente el diagnóstico de las enfermedades causadas por Yersinia, especialmente enterocolítica y pseudotuberculosis ha sido el cultivo y aislamiento a partir del mismo de la bacteria. Se puede cultivar con relativa facilidad a partir de fluidos corporales (fluidos cerebroespinal y peritoneal) y de tejidos. El aislamiento a partir de heces es mucho más complicado por la interferencia de la flora fecal, requiriéndose medios selectivos y cultivo a bajas temperaturas durante largos tiempos. En todo caso el procedimiento es largo y laborioso y requiere personal experimentado.

La forma más común de diagnosticar las enfermedades causadas por Yersínía es un inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos (lgG oigA) anti Yersínia en el suero. El inmunoensayo puede ser una aglutinación, un inmunoblot (como el recomLine Yersinia de Mikrogen GmbH, Neuried, Alemania) o un ELlSA (como el Serian Elisa Yersinia de Serian Immundiagnostica GmbH, Würzburg, Alemania) . Dependiendo del antígeno utilizado para realizar el inmunoensayo pueden aparecer reacciones cruzadas con Salmonella, Brucella, Escherichia coli y Vibrio. Para superar estos inconvenientes se propone la utilización de otros antígenos más específicos de Yersinia como los descritos en el documento US 2011/0306515 Al.

El diagnóstico de Yersinia por técnicas de cultivo es largo y tedioso y presenta una sensibilidad muy baja. La detección de anticuerpos en el suero, además de tener falsos positivos, solo dice que el sistema inmunitario del individuo ha visto el antígeno, no que haya una enfermedad activa.

Solución del problema El objeto de la presente invención es un dispositivo de diagnóstiCO del tipo imunocromatográfico y su método de uso, para la determinación rápida y simultánea de los antígenos 0:3 y 0:9 de Yersinia enterocolítica en muestras fecales. Los cepas de Yersinia enterocolítíca con antígenos 0:3 y 0:9 son con diferencia las más frecuentes de todas las que causan enfermedad y entre las dos suman la gran mayoría de los casos encontrados.

El método presenta las siguientes ventajas:

Es rápido (basta resuspender la muestra en el diluyente, añadir unas gotas en el dispositivo y esperar 10 minutos) , sencillo (no se requiere ningún complicado instrumental de laboratorio) , el resultado es fácil de interpretar (aparece una línea indicando si el test es positivo o no) , y barato (especialmente porque no requiere inversión inicial y porque lo puede llevar a cabo personal no especializado) .

El dispositivo presenta las siguientes ventajas:

a. Se utiliza un vial específico que permite la toma de la muestra de manera fácil e higiénica.

b. Fiable. Lleva incorporada una línea de control cuya aparición verifica el correcto funcionamiento del test.

c. Detecta la presencia de la bacteria y no los anticuerpos que el organismo infectado produce. Se identifican simultánea y separadamente los antígenos 0:3 y 0:9 de Yersinia enterocolítíca.

Descripción breve El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos en la membrana del dispositivo.

El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces o cultivos de enriquecimiento.

El tiempo de preparación de la muestra son unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos EIA (fLlSA) , mucho más complejos de llevar a cabo y necesitan de instrumentación de laboratorio.

Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente cuando la muestra es fecal.

Además de con muestras de heces, el dispositivo de la invención también se puede utilizar para la identificación de Yersinia enterocolítica a partir de cultivos o coprocultivos en medios de enriquecimiento ya sean selectivos o no y se realicen en medio líquido o semisólido (agar) . En particular resulta adecuada la utilización del medio CIN (Cefsulodina-Irgasan-Novobiocina) cultivado entre 25 oC y 37 oC durante 24-48h. Cuando el cultivo se realiza en placas de agar, como en este caso, se procede a dispersar una o varias colonias en el diluyente antes de adicionarlo al dispositivo inmunocromatográfico de la invención. En este caso el procedimiento debería realizarse en un laboratorio con las medidas de seguridad y la experiencia adecuadas.

Descripción de la figuras Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales (Figura lA) es un vial de plástico de unos 3 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 mi de diluyente, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección de una muestra de heces (Figura lB) sólidas o semisólidas y su introducción en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura le) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 10) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo (Figura lE) .

Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatográfico.

Figura 2A: Vista del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1) , una membrana porosa (2)...

 


Reivindicaciones:

1. Dispositivo inmunocromatográfico para la detección de Yersinia enterocolítica en muestras biológicas caracterizado por que comprende una ventana de aplicación de la muestra, otra ventana de resultados y:

i) una tira inmunocromatográfica la cual comprende una zona (7) con conjugados de los anticuerpos monoclonales anti-Yersinia enterocolitica 0:3 y 0:9 con micropartículas inmunorreactivas y una zona de membrana porosa (2) que comprende anticuerpos anti-Yersinia enterocolitica 0:3 y 0:9 inmovilizados dispuestos por separado (3, 4) ,

o ii) dos tiras inmunocromatográficas, donde una tira comprende una zona (7) con conjugados del anticuerpo monoclonal anti-Yersinia enterocolitica 0:3 con micropartículas inmunorreactivas, y una zona de membrana porosa (2) que comprende anticuerpos anti-Yersinia enterocolitica 0:3 inmovilizados, y otra tira comprende una zona (7) con conjugados del anticuerpo monoclonal anti-Yersinia enterocolitica 0:9 con micropartículas inmunorreactivas, y una zona de membrana porosa (2) que comprende anticuerpos anti-Yersinia enterocolitica 0:9 inmovilizados.

2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación anterior donde las micropartículas in munorreactivas son coloreadas.

3. Dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las micropartículas inmunorreactivas son de poliestireno.

4. Uso de un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la detección de Yersinia enterocolítica en una muestra biológica.

5. Uso según la reivindicación anterior donde la muestra biológica es una muestra de heces.

6. Uso según la reivindicación 4 donde la muestra biológica es un cultivo de enriquecimiento.

7. Método de diagnóstico de las enfermedades causadas por Yersinia enterocolítica caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a. dispersión de una muestra biológica de heces o de un cultivo de enriquecimiento en un diluyente,

b. aplicación de la dispersión de a) en la ventana de muestra de un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

c. interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.

8. Kit para llevar a cabo el método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 7 caracterizado por que comprende:

a. un dispositivo inmunocromatográfico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,

b. un diluyente para la dispersión de la muestra biológica,

c. un vial para la toma de muestra y su manipulación.

FIGURA lA

FIGURA 1 B

FIGURA le FIGURA 1 D

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FIGURA 1 E

FIGURA 1

7

FIGURA 2A

FIGURA 2B FIGURA 2e ~ e ~ ~ T ~

A B

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FIGURA 2