MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO Y/O SEGUIMIENTO DE ASPERGILOSIS INVASIVAS.

Método para el diagnóstico de aspergillosis invasiva que comprende realizar un ensayo ELISPOT inmunoenzimático in vitro en el que el fluido biológico extraído del paciente se pone en contacto con un antígeno de Aspergillus fumigatus,

caracterizado porque dicho método comprende verificar la presencia de células T productoras de IFN-γ y células T productoras de IL-10 y/o la relación entre células T productoras de IFN-γ y células T productoras de IL-10.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IT2007/000867.

Solicitante: UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI MODENA E REGGIO EMILIA.

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA DELL'UNIVERSITÀ 4 41100 MODENA ITALIA.

Inventor/es: LUPPI,Mario, BAROZZI,Patrizia, POTENZA,Leonardo, TORELLI,Giuseppe.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 13 de Diciembre de 2007.

Clasificación PCT:

  • A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • G01N33/50 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.

PDF original: ES-2366492_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Descripción del sumario de la invención

La presente invención es un método para el diagnóstico de aspergilosis invasivas que comprende realizar un ensayo ELISPOT inmunoenzimático in vitro en el que el fluido biológico extraído del paciente se pone en contacto con un antígeno de Aspergillus fumigatus, que se caracteriza por comprender la verificación de la presencia de células T productoras de IFN-γ y células T productoras de IL-10 y/o la relación entre células T productoras de IFN-γ y células T productoras de IL-10.

En el método de acuerdo con la presente invención, dicho antígeno preferentemente es un antígeno extractivo de Aspergillus fumigatus; más preferentemente, dicho antígeno se obtiene a partir de conidios o hifas de Aspergillus fumigatus.

De acuerdo con una realización de la invención, dicho antígeno se obtiene por medio de los siguientes pasos:

- incubación de los conidios durante 3 días,

- recogida de los conidios por medio de lavado del cultivo fúngico con agua esterilizada,

- filtración y posterior centrifugación del líquido de lavado,

- eliminación del sobrenadante,

- congelación y posterior descongelación del sedimento de conidios,

- suspensión en agua esterilizada,

- ebullición y posterior centrifugación, y

- posible congelación.

De acuerdo con otra realización de la invención, dicho antígeno se obtiene por medio de los siguientes pasos:

- recogida de hifas de placas de cultivo mediante raspado y posterior suspensión en agua esterilizada,

- filtración y posterior centrifugación,

- eliminación del sobrenadante,

- congelación y posterior descongelación del sedimento del micete,

- homogeneización del micete en presencia de un volumen de perlas de material inerte (preferentemente

perlas de vidrio) igual al volumen del micete,

- centrifugación

- posible congelación.

De acuerdo con una realización de la invención, dicho fluido biológico se selecciona entre sangre, fluido de lavado broncoalveolar o fluido pleural.

De acuerdo con otra realización de la invención, dicho fluido biológico se selecciona entre todas las células mononucleares de la sangre, del fluido de lavado broncoalveolar, del fluido pleural o linfocitos T de la sangre, del fluido de lavado broncoalveolar, o del fluido pleural.

En el método de acuerdo con la presente invención, el valor umbral para IFN-γ o IL-10 está preferentemente en el intervalo de 15-25 SFC; más preferentemente, dicho valor umbral es 20 SFC.

Técnica anterior

Las infecciones fúngicas invasivas (IFI) representan una causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes afectados por hemopatías malignas, sometidos no sólo a trasplantes de médula alogénicos sino también a quimioterapia convencional. El riesgo de muerte en pacientes afectados por IFI alcanza incluso porcentajes del 90%.

El agente etiológico responsable de las IFI se representa por hongos de la especie Aspergillus, que constituyen casi el 90% de todas las infecciones invasivas. Las causas de esta alta mortalidad estriban en la ausencia de métodos de diagnóstico que permitan un diagnóstico de Aspergilosis Invasiva (AI). De hecho, los instrumentos disponibles para el hematólogo clínico están limitados por la invasividad, lentitud, baja sensibilidad, falta de estandarización y cinética variable (Hope WW 2005; Mennink-Kersten M 2004; Patterson TF 2005).

Los métodos que se usan actualmente para el diagnóstico de aspergilosis invasivas son el examen histológico, la tomografía axial computarizada de alta resolución de tórax (HRCT), exámenes de cultivos, exámenes serológicos (galactomanano, 1,3-beta-glucano) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para ácidos nucleicos de hongos.

Sin embargo, sólo el examen histológico y el examen de cultivos proporcionan una confirmación absoluta de AI, pero tienen límites de invasividad y baja sensibilidad (son positivos en un porcentaje menor de aproximadamente un 30%). La HRCT no es específica, mientras que el GM tiene una sensibilidad extremadamente variable (en un intervalo comprendido entre el 30% y el 100%) ya que se ve influenciada por numerosos factores que limitan su aplicación, incluyendo el uso de la profilaxis antifúngica y/o la dieta del paciente. Tanto los beta-glucanos como la PCR carecen de estandarización y tienen cinéticas completamente impredecibles. Además, la detección del ADN de Aspergillus a través de PCR se obstaculiza por las dificultades de comprensión de la liberación y cinética del ADN del hongo, además de las barreras técnicas (Hope WW, Denning DW. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis 2005; 5: 609-622).

Ciertos estudios recientes, primero en roedores y después también en seres humanos, demostraron que la inmunidad adaptativa, o la representada por las células T, realiza un papel predominante en la defensa del hospedador contra los hongos (Cenci E 1997; Hebart H 2002; Romani L 2004). En particular, una inmunidad mediada por células polarizada con células T auxiliares de tipo 1 (TH1), productoras de interferón-gamma (IFN-γ) protege contra las infecciones fúngicas, especialmente AI; mientras que una inmunidad mediada por células polarizada con células T auxiliares de tipo 2 (TH2), productoras de interleucina 10 (IL-10), es permisiva con respecto a AI (Cenci E 1997; Hebart H 2002; Romani L 2004).

El método ELISPOT (ElisaSpot o Ensayo InmunoSpot ligado a Enzimas) ha mostrado ser un instrumento sensible y específico en el diagnóstico de infecciones microbacterianas de tuberculosis o en infecciones de origen viral, tanto en sujetos inmunocompetentes como en sujetos inmunodeprimidos (Lalvani 2001), mediante la investigación de células T específicas de microbacterias, o para el aislamiento de células T específicas para el virus de Epstein-Barr en pacientes con trasplante renal (Comoli 2002).

ELISPOT es un ensayo basado en la respuesta inmunológica celular hacia un antígeno específico. Dicho método generalmente se realiza en placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpos monoclonales específicos, en los que se incuban las células y el antígeno específico durante 6-48 horas.

Durante dicho periodo se produce la respuesta celular y se producen las citocinas específicas, de acuerdo con el tipo de anticuerpo/antígeno usado, que genera manchas que se detectan y cuentan mediante un software común de análisis de imágenes.

En la solicitud de patente europea EP0957359 (Volkmar et al.), incorporada en la presente memoria con fines de referencia, se describe el método ELISPOT para una evaluación genérica de la actividad de células sanguíneas.

En la solicitud de patente internacional WO98/23960 (Lalvani et al.), incorporada en la presente memoria con fines de referencia, se describe el método ELISPOT aplicado a los linfocitos T para el diagnóstico o seguimiento de enfermedades tales como hepatitis B, hepatitis C, tuberculosis, malaria, VIH o gripe.

En la solicitud de patente internacional WO00/26248 (Lalvani et al.), incorporada en la presente memoria con fines de referencia, se describe el método ELISPOT aplicado a los linfocitos T reactivos con los antígenos procedentes de la proteína ESAT-6 expresada por Mycobacterium tuberculosis, para el diagnóstico de la tuberculosis o incluso únicamente en el contacto del hospedador con el patógeno (enfermedad latente).

En la solicitud de patente internacional WO2004/005925 (Lalvani et al.), incorporada en la presente memoria con fines de referencia, se describe otro método ELISPOT aplicado a los linfocitos T reactivos no sólo con los antígenos derivados de ESAT-6 sino también de la proteína CFP-10.

Por lo tanto, el método ELISPOT se ha utilizado hasta ahora para infecciones y enfermedades de origen viral, o para Mycobacterium tuberculosis.

Trull et al., Journal of Clinical Pathology, Vol. 38, nº 9, 1985, páginas 1045-1047 y el documento US 2002/061544 describen métodos para el diagnóstico de aspergilosis invasivas por medio de ensayos inmunoenzimáticos con un antígeno de Aspergillus fumigatus.

En Gaziano et al., Antimicrobical Agents and Chemotherapy, Vol.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para el diagnóstico de aspergillosis invasiva que comprende realizar un ensayo ELISPOT inmunoenzimático in vitro en el que el fluido biológico extraído del paciente se pone en contacto con un antígeno de Aspergillus fumigatus, caracterizado porque dicho método comprende verificar la presencia de células T productoras de IFN-γ y células T productoras de IL-10 y/o la relación entre células T productoras de IFN-γ y células T productoras de IL-10.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho antígeno es un antígeno extractivo de Aspergillus fumigatus.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho antígeno se obtiene a partir de conidios de Aspergillus fumigatus.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho antígeno se obtiene a partir de hifas de Aspergillus fumigatus.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho antígeno se obtiene mediante los siguientes pasos:

- incubación de los conidios durante 3 días, -recogida de los conidios por medio de lavado del cultivo fúngico con agua esterilizada, -filtración y posterior centrifugación del líquido de lavado, -eliminación del sobrenadante, -congelación y posterior descongelación del sedimento de conidios, -suspensión en agua esterilizada, -ebullición y posterior centrifugación, y -posible congelación.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho antígeno se obtiene mediante los siguientes pasos:

- recogida de hifas de placas de cultivo mediante raspado y posterior suspensión en agua esterilizada, -filtración y posterior centrifugación, -eliminación del sobrenadante, -congelación y posterior descongelación del sedimento del micete, -homogeneización del micete en presencia de un volumen de perlas de material inerte igual al volumen del micete, -centrifugación -posible congelación.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dichas perlas están hechas de vidrio.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fluido biológico se selecciona entre sangre, fluido de lavado broncoalveolar o fluido pleural.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fluido biológico se selecciona entre todas las células mononucleares de la sangre, del fluido del lavado broncoalveolar, del fluido pleural, o linfocitos T de la sangre, del fluido del lavado broncoalveolar o del fluido pleural.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el valor umbral para IFN-γ o IL-10 está en el intervalo de 15-25 SFC.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho valor umbral es 20 SFC.

 

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