Método para el diagnóstico y/o pronóstico de linfomas.

Método para el diagnóstico y/o pronóstico de linfomas.

La presente invención se refiere a un método diagnóstico y/o pronóstico de las enfermedades neoplásicas del tejido linfoide,

preferiblemente del linfoma T y del linterna de Hodgkin, basado en la cuantificación de la expresión de la proteína colony-stimutating factor 1 receptor (CSF1R).

Metodo para el diagnostico y/o pronostico de linfomas.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se encuadra en el campo de las enfermedades neoplasicas del tejido linfoide, concretamente dentro de los metodos de diagnostico y/o pronostico de este tipo de enfermedades, preferiblemente del linfoma de celulas T y del Linfoma de Hodgkin, que se basa en la cuantificacion de la expresion de la proteina colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) mediante un anticuerpo monoclonal anti-CSF1R (Clon FER216D) .

ESTADO DE LA TECNICA

La patologia tumoral linfoide, que incluye tanto los linfomas no hodgkinianos como el Linfoma de Hodgkin (LH) , representa un grupo muy heterogeneo de neoplasias que tienen en comun su origen en la proliferacion de celulas linfoides detenidas en diferentes etapas de su desarrollo madurativo. Asi pues, se incluyen dentro de los linfomas enfermedades muy distintas desde el punto de vista histologico, clinico y evolutivo, que precisan de tratamientos que dependen en gran medida de la agresividad del linfoma.

La enfermedad de Hodgkin es un cancer del tejido linfatico que se encuentra principalmente en los ganglios linfaticos, el bazo, el higado y la medula osea. Actualmente, la enfermedad se diagnostica mediante la biopsia del tejido sospechoso, de forma habitual, los ganglios linfaticos, o de la medula osea. Una vez realizada la biopsia y obtenido el tejido, este se examina al microscopio, estudiando y analizando el tamaro y la forma de las celulas. Adicionalmente, se pueden llevar a cabo pruebas de inmunohistoquimica sobre el tejido biopsiado, para detectar la presencia de ciertas proteinas en la superficie de las celulas Hodgkin Reed Sternberg (tales como CD15 y CD30) que son indicativas de que el sujeto de estudio padece linfoma de Hodgkin.

Actualmente para realizar un correcto diagnostico de LH a nivel de Anatomia patologica se realiza el marcaje inmunohistoquimico de biopsias de pacientes con sospecha de linfoma con anticuerpos frente a CD15, CD20, CD30, LMP, Bcl2 y CD3, CD68 ademas de Hematoxilina-Eosina. Los metodos de estratificacion actuales no permiten una correcta identificacion de los pacientes con alto riesgo de no responder a las terapias estandar o de recaer antes de 2 aros tras la recuperacion completa, por lo que es necesario crear nuevos metodos o protocolos que permitan la identificacion de estos pacientes.

COMPENDIO DE LA INVENCION

Los inventores de la presente invencion han desarrollado un anticuerpo que reconoce de forma especifica la proteina CSF1R con una sensibilidad y especificidad mayor que otro anticuerpo descrito en el estado de la tecnica. Para obtener dicho anticuerpo, los inventores utilizaron una proteina recombinante que comprende el dominio extracelular de CSF1R y el dominio C-terminal de IgG1 humana, para despues inmunizar un raton con dicha proteina, y obtener asi hibridomas capaces de secretar el anticuerpo de la invencion. El anticuerpo asi producido, presenta no solo mayor especificidad y sensibilidad que los anticuerpos disponibles comercialmente, sino que muestra una mejor relacion seral/background en estudios inmunohistoquimicos sobre muestras fijadas en formol e incluidas en parafina, y un mayor espectro de aplicaciones, tales como inmunohistoquimica, inmunofluorescencia, citometria de flujo, ELISA, western-blot e inmunoprecipitacion.

Por otro lado, se observo una expresion diferencial de la proteina CSF1R en muestras de tejido tumoral de pacientes con distintos tipos de linfoma, especialmente en linfomas de Hodgkin y linfoma de celulas T, y una asociacion estadisticamente significativa entre la sobreexpresion de CSF1R en el microambiente tumoral y una supervivencia global mayor de los pacientes, lo que permite el empleo del anticuerpo de la invencion en el diagnostico y/o pronostico en linfomas de Hodgkin y linfoma de celulas T.

Asi, en un primer aspecto, la invencion se relaciona con un metodo de obtencion de un anticuerpo monoclonal frente a la proteina CSF1R que comprende:

a. inmunizar a un animal no-humano con una proteina recombinante que comprende el dominio extracelular de la proteina CSF1R y el dominio C-terminal de IgG1 humana, y

b. obtener hibridomas a partir del animal inmunizado que generen anticuerpos monoclonales frente a la proteina CSF1R.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un anticuerpo monoclonal obtenido mediante el metodo de obtencion de anticuerpos monoclonales descrito en la presente invencion.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de un anticuerpo monoclonal segun la presente invencion para la deteccion in vitro de la proteina CSF1R o una variante funcionalmente equivalente de la misma, y para el diagnostico y/o pronostico in vitro de linfomas.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo para el diagnostico y/o pronostico in vitro de linfoma de celulas T o linfoma de Hodgkin en un sujeto que presenta una neoplasia linfoide, que comprende las siguientes etapas:

a) cuantificar la cantidad del producto de la expresion del gen CSF1R en una muestra biologica aislada de un sujeto que presenta una neoplasia linfoide; y b) comparar la cantidad cuantificada en el paso (a) con una cantidad de referencia.

Finalmente, en otro aspecto, la invencion de relaciona con un kit para llevar a cabo cualquiera de los metodos definidos en la presente invencion que comprende al menos un elemento necesario para cuantificar el producto de la expresion del gen CSF1R, donde dicho elemento se selecciona de la lista que consiste en un anticuerpo anti-CSF1R y un cebador

o una sonda especificos del gen CSF1R, y el uso de dicho kit para llevar acabo cualquiera de dichos metodos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Produccion e identificacion de la proteina recombinante CSFR1-Fc. Purificacion por cromatografia de afinidad en columna de Proteina A.

FIG. 2. A) Marcajes inmunohistoquimica (IHQ) de cito-spin de celulas Hek que sobre-expresan CSF1R o FGFR como controles positivos y negativos respectivamente. B) Western blotting de extractos proteicos de controles positivos, negativos, tejidos control, casos de Linfoma de Hodgkin y diversas lineas celulares de Linfoma de Hodgkin marcados (de arriba abajo) con el anticuerpo FER216D, el Anticuerpo de R&D systems™ (clon 61710) y tubulina como control de carga. C) Inmunoprecipitacion con el anticuerpo producido y marcaje con el anticuerpo de R&D (izquierda) y viceversa (derecha) . Se emplea proteina total extraida de amigdala, un caso de LH y 2 lineas celulares de Linfoma de Hodgkin.

FIG. 3 Expresion de CD68, CSF1R y CD163 en tejido linfoide reactivo (ganglios, amigdala, bazo, medula osea y timo) .

FIG. 4. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier en muestras de linfomas de Hodgkin.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Tal como se ha explicado previamente, los inventores de la presente invencion han desarrollado un anticuerpo que reconoce de forma especifica la proteina CSF1R con una sensibilidad y especificidad mayor que el resto de anticuerpos descritos en el estado de la tecnica.

Para obtener dicho anticuerpo, los inventores utilizaron una proteina recombinante que comprende el dominio extracelular de CSF1R y el dominio C-terminal de IgG1 humana, para despues inmunizar un raton con dicha proteina, y obtener asi hibridomas capaces de secretar el anticuerpo de la invencion (Ejemplo 1) . El anticuerpo asi producido, presenta no solo mayor especificidad y sensibilidad que los anticuerpos disponibles comercialmente (Ejemplo 2) , sino que muestra una mejor relacion seral/background en estudios inmunohistoquimicos sobre muestras fijadas en formol e incluidas en parafina, y un mayor espectro de aplicaciones, tales como inmunohistoquimica, inmunofluorescencia, citometria de flujo, ELISA, western-blot e inmunoprecipitacion.

Por otro lado, se observo una expresion diferencial de la proteina CSF1R en muestras de tejido tumoral de pacientes con distintos tipos de linfoma, especialmente en linfomas de Hodgkin y linfoma de celulas T (Ejemplo 3) , y una asociacion estadisticamente significativa entre la sobreexpresion de CSF1R en el microambiente tumoral y una supervivencia global mayor del paciente (Ejemplo 3) , lo que permite el empleo del anticuerpo de la invencion en el diagnostico y/o pronostico en linfomas de Hodgkin y linfoma de celulas T.

Por ello, la presente invencion propone el uso del anticuerpo monoclonal anti-CSF1R FER 216D frente a la proteina CSF1R para el diagnostico y/o pronostico in vitro de linfoma de celulas T y Linfoma de Hodgkin en un sujeto que presenta una neoplasia linfoide, y por tanto proporciona un metodo mejorado de deteccion de linfoma de celulas T y Linfoma de Hodgkin en neoplasia linfoide y un metodo mejorado... [Seguir leyendo]

Un metodo para el diagnostico in vitro de linfoma de celulas T o linfoma de Hodgkin en un sujeto que presenta una neoplasia linfoide, que comprende las siguientes etapas: a) cuantificar la cantidad del producto de la expresion del gen CSF1R en una muestra biologica aislada de un sujeto que presenta una neoplasia linfoide; y b) comparar la cantidad cuantificada en el paso (a) con una cantidad de referencia. 2 El metodo segun la reivindicacion 1, donde la muestra biologica se selecciona entre ganglios, amigdala, bazo, medula osea o timo. 3 El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde la muestra biologica comprende celulas tumorales.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la cantidad de referencia corresponde al valor obtenido tras cuantificar la cantidad del producto de expresion del gen CSF1R en una muestra biologica aislada de un sujeto que presenta una neoplasia linfoide que no es ni un linfoma de celulas T ni un linfoma de Hodgkin.

El metodo de diagnostico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que ademas comprende:

c) asignar al sujeto que presenta una neoplasia linfoide al grupo de pacientes con linfoma de celulas T o con linfoma de Hodgkin cuando la cantidad detectada en la etapa a) es significativamente mayor que la cantidad de referencia.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el producto de la expresion del gen CSF1R es la proteina CSF1R o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

El metodo segun la reivindicacion 6, donde la cuantificacion de la proteina CSF1R se lleva a cabo mediante el empleo de un anticuerpo obtenido mediante un metodo que comprende a) inmunizar a un animal no-humano con una proteina recombinante que comprende el dominio extracelular de CSF1R y el dominio C-terminal de IgG1 humana, y b) obtener hibridomas a partir del animal inmunizado que generen anticuerpos monoclonales frente a la proteina CSF1R. 8 El metodo segun la reivindicacion 7, en el que el metodo para obtener el anticuerpo comprende una etapa c) de aislamiento del anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma generado en la etapa b) .

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde el animal no-humano es un mamifero, preferiblemente, un mamifero seleccionado entre un cerdo, un chimpance, un raton, una rata, un conejo y una cobaya.

Un metodo para el pronostico in vitro de linfoma de celulas T o linfoma de Hodgkin en un sujeto que presenta una neoplasia linfoide, que comprende las siguientes etapas:

a) cuantificar la cantidad del producto de la expresion del gen CSF1R en una muestra biologica aislada de un sujeto que presenta una neoplasia linfoide; y

b) comparar la cantidad cuantificada en el etapa (a) con una cantidad de referencia.

El metodo segun la reivindicacion 10, donde la muestra biologica se selecciona entre ganglios, amigdala, bazo, medula osea o timo.

El Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde la muestra biologica procede del microambiente tumoral.

El metodo segun la reivindicacion 12, donde la muestra biologica que procede del microambiente tumoral comprende ademas linfocitos.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que ademas comprende:

c) asignar al sujeto que presenta una neoplasia linfoide al grupo de pacientes con un buen pronostico de linfoma de Hodgkin cuando la cantidad detectada en el etapa (a) es significativamente mayor que la cantidad de referencia.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde el producto de la expresion del gen CSF1R es la proteina CSF1R o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

El metodo segun la reivindicacion 15, donde la cuantificacion de la proteina CSF1R se lleva a cabo mediante el empleo de un anticuerpo obtenido mediante un metodo que comprende a) inmunizar a un animal no-humano con una proteina recombinante que comprende el dominio extracelular de CSF1R y el dominio C-terminal de IgG1 humana, y b) obtener hibridomas a partir del animal inmunizado que generen anticuerpos monoclonales frente a la proteina CSF1R.

El metodo segun la reivindicacion 16, en el que el metodo para obtener el anticuerpo comprende una etapa c) de aislamiento del anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma generado en la etapa b) .

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, donde el animal no-humano es un mamifero, preferiblemente, un mamifero seleccionado entre un cerdo, un chimpance, un raton, una rata, un conejo y una cobaya.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, donde en la etapa (a) ademas se cuantifica la cantidad del producto de la expresion del gen FOXP3.

El metodo segun la reivindicacion 19, el producto de expresion del gen FOXP3 es la proteina FOXP3.

Kit para llevar a cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 que comprende al menos un elemento necesario para cuantificar el producto de la expresion del gen CSF1R, donde dicho elemento se selecciona de la lista que consiste en un anticuerpo anti-CSF1R y un cebador o una sonda especificos del gen CSF1R.

Kit segun la reivindicacion 21, donde el anticuerpo anti-CSF1R es un anticuerpo monoclonal obtenido mediante un metodo que comprende a) inmunizar a un animal no-humano con una proteina recombinante que comprende el dominio extracelular de CSF1R y el dominio C-terminal de IgG1 humana, y b) obtener hibridomas a partir del animal inmunizado que generen anticuerpos monoclonales frente a la proteina CSF1R. 23 Kit segun la reivindicacion 22, en el que el metodo para obtener el anticuerpo comprende una etapa c) de aislamiento del anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma generado en la etapa b) .

Kit segun cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23, donde el animal no-humano es un mamifero, preferiblemente, un mamifero seleccionado entre un cerdo, un chimpance, un raton, una rata, un conejo y una cobaya.

Kit segun la cualquiera de las reivindicaciones 21 o 24 que ademas comprende al menos un elemento necesario para cuantificar el producto de la expresion del gen FOXP3, donde dicho elemento se selecciona de la lista que consiste en un anticuerpo anti-FOXP3, un cebador y una sonda especificos del gen FOXP3.

Uso del kit segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 para llevar a cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

Uso de un kit segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26 para llevar cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20.

FIG. 1 A

B

CSF1R IgG-Cadenapesada

IgG-Cadenaligera FIG.2 A

FIG.3

FIG.4

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Fundación MD Anderson International EspañaFundación Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas <120> Método para el diagnóstico y/o pronóstico de linfomas <130> ES2822.1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteínaCSF1R

<400> 1

Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu1 5 10 15

Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys65 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95

Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110

Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125

Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140

Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu145 150 155 160

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175

Glu Cys Ser Ser Gln 180