MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE ARGININA Y SUS DERIVADOS METILADOS.

Método de detección y/o cuantificación de arginina y sus derivados metilados.

La presente invención se refiere a un método para la determinación, detección y/o cuantificación, de la concentración de arginina (Arg) y sus derivados metilados (ADMA, SDMA, MMA) en muestras biológicas mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) que comprende la preparación de la muestra mediante la adicción de estándares internos o análogos marcados isotópicamente (13C6-Arginina y D7-ADMA) y la centrifugación de la mezcla anterior.

Método de determinación de arginina y sus derivados metilados La presente invención se refiere a un método para la detección y/o cuantificación de arginina y sus derivados metilados. Además, se refiere a un kit para llevar a cabo dicho método.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La L-Arg (L-Arginina) puede oxidarse a L-citrulina y óxido nítrico (NO) por acción de óxido nítrico sintasa (NOS) endotelial, de la cual es el principal sustrato. En cambio, los residuos de Arg de las proteínas pueden metilarse de diferente manera para que su posterior proteolisis de lugar a tres tipos de compuestos: ADMA, SDMA y L-NMMA. La metilación de la Arg está catalizada por la proteína arginina metiltransferasa I y II (PRMT I y II) , cuya actividad depende de la S-adenosilmetionina como dador de grupos metilo. PRMT I produce ADMA, y PRMT II da lugar a L-NMMA y SDMA. El ADMA se produce en todas las células del organismo y compite con la Arg por las isoformas de la NOS. El enzima PRMT I se expresa predominantemente en el endotelio y en las células del músculo liso del sistema cardiovascular. En condiciones de estrés oxidativo, la actividad de PRMT I en las células endoteliales se incrementa dando lugar a un aumento en la producción de ADMA. Aunque el SDMA no inhibe la síntesis de NO de forma directa, puede competir con el transportador de aminoácidos catiónicos en la membrana de las células endoteliales, acentuando así la deficiencia de Arg y alterando la producción de NO indirectamente, ya que el propio SDMA reduce significativamente la reabsorción de Arg en el asa de Henle de las nefronas en las ratas. Por estas razones y debido a que el SDMA se elimina predominantemente por la orina, se ha estudiando su correlación con la función renal y como marcador de la arterioesclerosis.

La mayor parte del ADMA, pero no de SDMA, se degrada a citrulina y dimetilamina (esquema 1) por acción de la dimetilarginina dimetilaminohidrolasa (DDAH) , que se encuentra distribuída ampliamente por el organismo, principalmente en el hígado y el riñón, regulando así los niveles de ADMA, y por tanto de la síntesis de NO. Por estas razones, el descenso en la actividad de DDAH puede ser el principal mecanismo para la elevación de los niveles de ADMA.

Síntesis de proteínas Residuos de arginina metilados Citrulina + aminas Esquema 1

En diversos estudios, se ha relacionado los niveles plasmáticos de ADMA en sujetos sanos sin enfermedad cardiovascular aparente, con la edad, presión arterial, intolerancia a la glucosa y el espesor de la carótida íntima-media. Esto sugiere que un incremento en los niveles de ADMA son un marcador de un cambio arterioesclerótico. Por eso, se han utilizado los niveles de ADMA para valorar el riesgo cardiovascular, conociendo que el ADMA es predominantemente absorbido por las células endoteliales. Por lo que se debe tener en cuenta que un ligero cambio en los niveles plasmáticos de ADMA son suficientes para alterar significativamente los niveles intracelulares de ADMA y por tanto de modificar la producción de NO contribuyendo al desarrollo de la enfermedad cardiovascular. En condiciones patológicas, podría darse un incremento de 3 a 9 veces los niveles de ADMA en plasma, que inhibirían el 30-70 % de la producción de NO. Así, fueron estudiados los niveles plasmáticos de ADMA en pacientes con intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina o diabetes, mostrándose valores elevados de este metabolito. También se han relacionado niveles elevados de ADMA con el estrés oxidativo y la hipocolesterolemia, mediante una disminución de la actividad de DDAH. Recientemente se ha comprobado que el tabaquismo aumenta las concentraciones de ADMA y disminuye los de Arg, que podría deberse a que el sistema de transporte y+ se expresa de forma deficiente debido al humo del tabaco.

La producción de NO endotelial está reducida en enfermos renales, en parte por limitación en la síntesis del substrato Arg, y porque el ADMA, que es un inhibidor competitivo de la NOS, está aumentado. El ADMA se acumula en pacientes con fallo renal crónico, inhibiendo la actividad de la NOS, lo que podría explicar al menos en parte, la hipertensión y la disfunción endotelial que sufren estos pacientes. Cabe destacar que los niveles de ADMA se encuentran ya incrementados en pacientes con enfermedad renal incipiente e incluso con valores aún normales de función renal, lo que sugiere que sólo una mínima parte del ADMA circulante se excreta por la orina aunque se correlacione inversamente con la filtración glomerular. También niños que han sufrido un trasplante renal presentan niveles elevados de ADMA con respecto a niños sanos, además de un bajo poder de metilación, aunque ambas variables no se correlacionan. Recientemente se ha mostrado una actividad reducida de DDAH en modelo animal con fallo renal, mostrando elevación de los niveles de ADMA, los cuales dependen en mayor proporción de la actividad de su enzima degradatorio que de la filtración glomerular.

Por todas estas razones, se han desarrollado diversos métodos analíticos para cuantificar la Arg y sus derivados metilados, y satisfacer así la demanda generada. En el método ELISA con cuantificación por fotometría de placas (DLD Diagnostika GmbH fue el primer fabricante de estos métodos) el ADMA en las muestras está acilado y compite con el ADMA unido a la fase sólida para un determinado número de lugares de antisuero de conejo anti-ADMA ADMA (Schulze F et al., Clin Chem Lab Med 2004; 42 (12) : 1377-83) . Cuando el sistema se encuentra en equilibrio, los antígenos y los complejos antígeno-antisuero libres son eliminados mediante lavado. La cantidad de anticuerpo unida a la fase sólida es inversamente proporcional a la concentración de ADMA en las muestras. Los inconvenientes de este método radican en que sólo se puede determinar un compuesto de forma simultánea, en este caso ADMA o SDMA, y una baja precisión en las medidas unida a errores sistemáticos. Pero el campo del HPLC-MS/MS aporta una mayor robustez a los métodos analíticos, permitiendo cuantificar Arg, ADMA y SDMA en el mismo experimento.

Los primeros métodos cromatográficos desarrollados incluían una derivatización de Arg, ADMA y SDMA previa a su separación cromatográfica, empleando orto-ftaldialdehído de forma que los compuestos producidos pueden ser cuantificados a través de un detector de fluorescencia (Teerlink T, et al., Anal Biochem. 2002; 303 (2) : 131-7) . La mayor desventaja de estos métodos es la extracción de los compuestos y su derivatización, que además de ser laboriosa, puede relacionarse con pérdida de sensibilidad y precisan un elevado tiempo de preparación de las muestras. Otros métodos donde el HPLC está acoplado a un espectrómetro de masas simple necesitan derivatizar las muestras para conseguir los butil ésteres derivados de los compuestos objeto de estudio (Schwedhelm E, et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2007; 851 (1-2) :211-9) .

También existen métodos que no utilizan la cromatografía para separar los isómeros ADMA y SDMA, pero dichos métodos emplean una transición m/z menos sensible que la 203.2 m/z → 70.1 m/z para cuantificar ADMA y SDMA, por lo que se pierde mucha sensibilidad. El fragmento 70.1 m/z es el más abundante cuando rompemos las moléculas de ADMA y SDMA en el espectrómetro de masas (Weaving G, et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2008; 874 (1-2) :27-32) . Además de separar cromatográficamente los compuestos, el HPLC es necesario porque minimiza los efectos asociados a la matriz de la muestra y elimina potencialmente la interferencia de otros compuestos presentes en la muestra (Martens-Lobenhoffer J, et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2009; 877 (27) :3261-6) .

Por tanto, la espectrometría de masas ha permitido emplear métodos más sencillos de preparación de las muestras, conservando precisión y exactitud en la cuantificación. Inicialmente se utilizó 13C6-Arg únicamente como estándar interno, siendo necesario el empleo de acetonitrilo y una posterior derivatización de los compuestos (Wang S, et al., Clin Chem Lab Med 2007; 45 (10) :1305-12) . Los métodos que emplean disolventes orgánicos para la precipitación de las proteínas en las muestras precisan también de una posterior evaporación de esos disolventes. Respecto a la derivatización de las muestras con métodos de HPLC-MS/MS, consume una serie de reactivos adicionales e incrementa el tiempo de preparación de la muestra, que a veces no provocan una mejora de los resultados cuantitativos (ES 2332218T3) .

Por tanto, los inconvenientes de los métodos descritos anteriormente, se basan en la necesidad de emplear disolventes orgánicos en la precipitación de proteínas de las muestras, la falta de... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección y/o cuantificación de arginina y sus derivados metilados seleccionados de entre dimetilarginina (ADMA) asimétrica, dimetilarginina simétrica (SDMA) y monometilarginina (MMA) , en muestras biológicas aisladas, mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS) , caracterizado porque la preparación de la muestra comprende: -la adicción de los estándares internos marcados isotópicamente 13C6-Arginina y D7-ADMA y opcionalmente agua; y -la centrifugación de la mezcla anterior en filtros de ultracentrífuga para la eliminación de proteínas a 15000-5000 rpm durant.

6. 20 minutos.

2. Método según la reivindicación 1, donde la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) .

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la separación cromatográfica de la arginina y sus derivados metilados se lleva acabo en una columna de gel de sílice y una fase móvil que contiene un formador de pares iónicos.

4. Método según la reivindicación anterior, donde el formador de pares iónicos se selecciona de entre ácido fórmico, ácido tricloroacético y ácido trifluoroacético.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde la separación cromatográfica se lleva a cabo a un pH ácido superior a 1, 5.

6. Método según la reivindicación 5, donde el pH está entre 2 y 3.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección y/o cuantificación se lleva a cabo a una transición de 203, 2 m/z → 70, 1 m/z para ADMA y SDMA.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección y/o cuantificación se lleva a cabo a una transición de 175 m/z → 70 m/z para arginina.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección y/o cuantificación se lleva a cabo a una transición de 181, 2 m/z → 74, 1 m/z para 13C6-Arg,

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección y/o cuantificación se lleva a cabo a una transición de 189, 2 m/z → 70, 1 m/z para MMA.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección y/o cuantificación se lleva a cabo a una transición de 210, 1 m/z → 77 m/z para D7-ADMA.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las muestras biológicas se seleccionan de entre fluido biológico o tejido.

13. Método según la reivindicación anterior, donde la muestra de fluido biológico se selecciona entre plasma, orina y líquido cefalorraquídeo.

14. Kit que comprende:

- los estándares (arginina, ADMA, SDMA y MMA) y los estándares internos marcados isotópicamente 13C6-Arg y D7- ADMA, -filtros de ultracentrífuga, -fase móvil.

15. Kit según la reivindicación anterior, donde la fase móvil comprende un formador de pares iónicos y se encuentra a un pH ácido mayor a 1, 5.

16. Kit según la reivindicación 15, donde el formador de pares iónicos se selecciona de entre ácido fórmico, ácido tricloroacético y ácido trifluoroacético.

17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la fase móvil se encuentra a un pH de entre 2 y 3.

18. Uso del kit descrito según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, para la detección y/o cuantificación mediante LC-MS/MS de arginina y sus derivados metilados seleccionado de entre dimetilarginina (ADMA) asimétrica, dimetilarginina simétrica (SDMA) y monometilarginina (MMA) , en muestras biológicas aisladas.

19. Uso del kit según la reivindicación 18, donde la muestra es un fluido biológico o un tejido.

20. Uso según la reivindicación anterior, donde la muestra de fluido biológico se selecciona entre plasma, orina y líquido cefalorraquídeo.

FIG.1

FIG. 2

FIG. 3

μM

μM

FIG. 4 (cont.)

μM

0 0, 5 1 μM 1, 5 2

15 FIG. 4