MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS DE UNA CLASE ESPECÍFICA UTILIZANDO UN ANTICUERPO INMUNOCOMPLEJO ESPECÍFICO.

Método para la determinación de anticuerpos de una clase específica utilizando un anticuerpo inmunocomplejo específico La presente invención se refiere a un método para la determinación de anticuerpos específicos de antígeno de una clase específica de inmunoglobulina en una muestra, por medio de un inmunoensayo en (microspot array format), en el que varios miembros de unión Bnx se unen de manera específica en diferentes áreas discretas sobre un soporte, en el que Bnx contiene en cada caso los diferentes antígenos que son capaces de unirse específicamente a los anticuerpos a detectar por incubación del soporte con la muestra, retirando el exceso de inmunoglobulina e incubando con un miembro de unión B2, que es un anticuerpo o un fragmento del mismo y que lleva una etiqueta y, detectando posteriormente la etiqueta en las respectivas áreas discretas, caracterizado porque el miembro de unión es utilizado como B2 que se une específicamente a anticuerpos de una cierta clase de inmunoglobulina que han sido unidos de manera específica de antígeno, mientras que las inmunoglobulinas unidas de manera no específica a la fase sólida no son detectadas o lo son, solamente, en una medida que se puede despreciar. En particular, la invención se refiere a un método para reducir el valor de nulo (blank) debido a anticuerpos específicos no antígenos, unidos de manera no específica en inmunoensayos en un formato de disposición microespacio para detectar anticuerpos específicos de antígeno. El sistema inmune del organismo de un mamífero produce anticuerpos que son llamados también inmunoglobulinas, como respuesta a la introducción de substancias extrañas. Se utilizan para defenderse contra las substancias extrañas a la que se hace referencia también como antígenos. Las inmunoglobulinas pueden ser divididas en cinco clases distintas. Se distinguen inmunoglobulinas de las clases M, G, A, E y D. Estas cinco clases de inmunoglobulinas difieren entre sí con respecto a la composición de la cadena pesada, a la que se hace referencia como cadena µ, , , o . Cada clase de inmunoglobulina tiene una función distinta en el organismo. Las inmunoglobulinas de clase M aparecen cuando se hace un primer contacto con el antígeno, la llamada inmunización primaria. No obstante, la concentración de estas inmunoglobulinas disminuye rápidamente al avanzar la infección. Las inmunoglobulinas de clase G son formadas al principio lentamente durante una inmunización primaria, y aparecen en grandes cantidades cuando existe una segunda infección con el mismo antígeno. Las inmunoglobulinas de clase A se encuentran en las superficies mucosas del organismo y son responsables de los procesos de defensa que tienen lugar en el mismo. Las inmunoglobulinas de clase E son principalmente responsables de las reacciones alérgicas. La función exacta de las inmunoglobulinas de clase D es desconocida hasta el momento. Las clases de inmunoglobulinas individuales aparecen en la sangre en concentraciones muy diferentes. De este modo, las inmunoglobulinas de clase G (IgG) son la clase que aparece en mayor proporción en el suero humano, encontrándose presentes en una proporción aproximada de 75%, que corresponde a un contenido en suero de 8 a 18 mg/ml. La segunda inmunoglobulina más frecuente es IgA, cuyo promedio de concentración en suero es de 0,9 a 4,5 mg/ml. Las inmunoglobulinas de clase M se encuentran presentes con una concentración de 0,6 a 2,8 mg/ml y las inmunoglobulinas de clase D se encuentran presentes con una concentración de 0,003 a 0,4 mg/ml. Los anticuerpos IgE se encuentran presentes en la proporción más baja y se presentan solamente con una concentración de 0,02 a 0,05 µg/ml en el suero. Para diagnósticos diferenciales de muchas enfermedades, es importante detectar anticuerpos de una o varias clases particulares de inmunoglobulina que son específicos para un cierto antígeno. Un diagnóstico satisfactorio, en el caso de infección vírica, bacteriana y parasítica, se puede asegurar solamente por medio de la detección de un anticuerpo de clase específica o excluyendo la presencia de ciertas clases de inmunoglobulina (por ejemplo, detección de anticuerpos IgG y IgA pero sin detección de anticuerpos IgM). Esto es, particularmente, importante para diferenciar entre infecciones recientes o agudas y las infecciones más antiguas, así como para monitorizar clínicamente el curso de una infección. La detección de anticuerpos de clase específica es especialmente importante para HIV, hepatitis A, hepatitis B, toxoplasmosis, rubella y clamidias en sus correspondientes infecciones. La detección específica de clase de anticuerpos que son específicos para un cierto antígeno es necesario también cuando se determina la titulación de anticuerpos de protección y para comprobar si una inmunización ha sido satisfactoria. Se describen varios métodos en la técnica anterior para detectar anticuerpos de una clase particular que son específicos para un antígeno. De este modo, anticuerpos específicos de antígeno de una clase particular, son detectados frecuentemente al unir el anticuerpo específico a una fase sólida recubierta con el antígeno específico. Las inmunoglobulinas (Ig) que son específicas para el antígeno y que están unidas a la fase sólida son detectadas por la unión con anticuerpos que están dirigidos específicamente contra Ig humana de una cierta clase a las moléculas (Ig) a detectar. Los anticuerpos, que están dirigidos contra Ig humana, están dotados de una etiqueta que es utilizada para la detección. No obstante, este procedimiento de pruebas es posible solamente cuando la totalidad de la Ig no unida, no específica, es retirada por lavado antes de la reacción con los anticuerpos etiquetados de manera específica de clase contra Ig humana. De este modo, por ejemplo, cuando se detectan moléculas Ig específicas en una muestra, cantidades relativamente grandes (4-20 mg/ml) de IgG no específicas se encuentran presentes que 2 ES 2 366 123 T3 pueden absorber de manera específica para la muestra en diferentes proporciones y unirse de manera no específica a la fase sólida. Si se utiliza un anticuerpo de detección contra las IgG, estas inmunoglobulinas unidas de manera no específica también se reconocerán y se unirán. Esto tiene como resultado elevadas señales de fondo y una sensibilidad reducida. Un método para reducir estas señales de fondo consiste en modificar la fase sólida a efectos de evitar unión no específica de las inmunoglobulinas y utilizar aditivos tampón especiales que están destinados también a impedir la unión de inmunoglobulinas a la fase sólida (ejemplos: HydroGel de fase sólida (Perkin Elmer), Fast Slides (Schleicher & Schüll), detergentes, sales caotrópicas). Las modificaciones de la fase sólida son laboriosas y caras. Además, ha resultado que los aditivos tampón pueden reducir la reactividad de algunos anticuerpos y, por lo tanto, puede reducir las señales. Las señales de fondo inducidas por inmunoglobulinas unidas de manera no específica incrementan el valor en blanco, lo que hace más difícil detectar anticuerpos específicos de una cierta clase de inmunoglobulina, especialmente en el caso de pruebas miniaturizadas, tales como inmunoensayos en un formato que comprende una serie de pruebas específicas, en algunos casos en formatos de prueba diferentes en un recipiente de reacción. Así, por ejemplo, la adición de un cierto detergente puede suprimir la unión no específica de anticuerpos, pero el mismo detergente puede no tener efectos, o incluso, el efecto opuesto en otra prueba en el mismo sistema de disposición. La utilización del factor de coagulación Clq, que es una subunidad del primer componente complementario como otra posibilidad de reducir señales de fondo en inmunoensayos, se da a conocer en el documento EP0222146B1. La proteína C1q unida a un soporte es utilizada en este caso para eliminar selectivamente complejos inmunes circulantes in vivo de la sangre por medio de adsorción inmune extracorpórea, en la que complejos inmunes unidos a la proteína C1q son separados de los fluidos corporales por separación de la fase sólida. En el documento US5698449A1, se da a conocer un fragmento de C1q para eliminar selectivamente complejos inmunes de la sangre y para detectar y cuantificar los complejos inmunes. Además, el documento US4062935A1 describe la adición de factores reumatoides o C1q a la muestra, y la unión y cuantificación de los complejos inmunes resultantes. No obstante, la técnica anterior descrita en esta descripción no muestra ninguna aplicación para inmunoensayos en formato de disposición (array format). Una particularidad característica de los inmunoensayos en formato de disposición es la fase sólida. En estos métodos, la fase sólida consiste, preferentemente, en áreas de pruebas localizadas que comprenden... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación de anticuerpos específicos de antígeno de una clase de inmunoglobulina específica en una muestra por medio de un inmunoensayo en formato microspot array, en el que varios miembros de unión Bnx son unidos sobre diferentes áreas sobre un soporte en el que Bnx contiene, en cada caso, los diferentes antígenos que son capaces de unirse específicamente a los anticuerpos a detectar al incubar el soporte con la muestra, retirando el exceso de inmunoglobulina e incubando con un miembro de unión B2 que es un anticuerpo o un fragmento del mismo y que lleva una etiqueta, y detectando subsiguientemente la etiqueta sobre las respectivas áreas discretas, caracterizado porque se utiliza un miembro de unión como B2 que se une específicamente a anticuerpos de una cierta clase de inmunoglobulina que han sido unidos en forma específica de antígeno mientras que las inmunoglobulinas que están unidas de manera no específica a la fase sólida no son detectadas o lo son solamente en una magnitud despreciable. 2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque B2 es un anticuerpo que se une a un nuevo epítopo o lugar de unión de un anticuerpo, formado cuando el antígeno se une al anticuerpo específico. 3. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque B2 es un anticuerpo que tiene baja afinidad, que tiene, como mínimo, dos, preferentemente, un mínimo de 4 y en particular preferentemente 10 o más paratopos. 4. Método, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utiliza biotina/estreptavidina, biotina/avidina, hapteno/antiapteno, fragmento de Fc de un anticuerpo/anticuerpo contra este fragmento Fc, o carbohidrato/lecitina como sistema de unión específico para la unión de Bnx a la fase sólida. 5. Método, según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el miembro de unión B2 es etiquetado con una substancia quimioluminiscente, fluorescente o radioactiva. 6. Método para reducir el valor de nulo en un inmunoensayo para la detección de anticuerpos de una clase especifica en un formato microspot array, en el que varios miembros de unión Bnx son unidos en diferentes áreas discretas sobre un soporte, según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza un miembro de unión como B2 que es un anticuerpo o fragmento del mismo y que lleva una etiqueta y que une específicamente anticuerpos de una determinada clase de inmunoglobulina que han sido unidos de manera específica de antígeno. 7. Kit de pruebas para determinar anticuerpos específicos de antígeno de una cierta clase de inmunoglobulina en una muestra por medio de un inmunoensayo, caracterizado por un formato microspot array conteniendo un soporte sobre el que están unidos varios miembros de unión Bnx sobre diferentes áreas discretas, reactivos de detección en contenedores separados, así como, el miembro de unión B2 que es un anticuerpo o un fragmento del mismo y que lleva una etiqueta y une específicamente anticuerpos de una clase de inmunoglobulina específica que han sido unidos de manera específica de antígeno. 13